جداسازي و شناسايي آسپرژيلوس فوميگاتوس در نمونه‌هاي لاواژ برونكوآلويولار (BAL) مشكوك به سل به روش Nested-PCR

Detection and Identification of Aspergillus fumigatus in BAL Samples of Patients with Suspected Tuberculosis by Nested-PCR

زمينه و اهداف: آسپرژيلوس فوميگاتوس عامل بيش از 90% آسپرژيلوزيس مهاجم حاد ريوي است. هدف از مطالعه حاضر شناسايي و رديابي آسپرژيلوس فوميگاتوس در نمونه‌هاي لاواژ برونكوآلويولار (BAL) مشكوك به سل به روش Nested-PCR است. مواد و روش كار: در اين بررسي، در طي 9 ماه در طول سال هاي 92-91 تعداد 100 نمونه BAL از بيماران بستري و مراجعه كننده به بيمارستان آموزشي در شمال تهران جمع آوري گرديد، آزمايش مستقيم، كشت و PCR بر روي نمونه هاي مورد مطالعه صورت گرفت، به منظور استخراج DNA از روش دستي فنل –كلروفرم استفاده گرديد. جهت انجام Duplex PCR از پرايمرهاي اختصاصي جنس آسپرژيلوس و پرايمرهاي بتااكتين استفاده شد. به منظور شناسايي گونه آسپرژيلوس فوميگاتوس از يك جفت پرايمر داخلي(روش Nested-PCR ) و جهت تاييد، تعدادي از محصولات PCR تعيين توالي گرديد. يافته‌ها: به روش PCR آسپرژيلوس در 12 نمونه(12%) تشخيص داده شد، موارد مثبت در روش مستقيم و كشت به ترتيب 11% و 10% بود. حساسيت و اختصاصيت روش مولكولي PCR در مقايسه با آزمايش مستقيم به ترتيب 100% و 8/98% بود. همچنين حساسيت و اختصاصيت اين روش در مقايسه با كشت به ترتيب 100% و 7/97% محاسبه گرديد. نتايج تعيين توالي تعدادي از محصولات PCR وجود آسپرژيلوس فوميگاتوس را تاييد نمود. نتيجه‌گيري: اين مطالعه نشان داد كه روش PCR، در مقايسه با روش مستقيم و كشت، حساسيت بالاتري در شناسايي و رديابي آسپرژيلوس دارا مي‌باشد، همچنين در نمونه هاي BAL مشكوك به سل مي‌توان آسپرژيلوس ها و به ويژه آسپرژيلوس فوميگاتوس را مدنظر قرار داد.

Background and Aim: Aspergillus fumigatus is the cause of more than 90% of invasive pulmonary aspergillosis. The aim of this study is identification and detection of A.fumigatus in bronchoalveolar lavage (BAL) samples patients suspected to have tuberculosis by using of Nested-PCR. Materials and Methods: In this assay, a set of 100 BAL samples which were collected in 9 month, between the years 2012-2013, from patients with suspected tuberculosis in Tehran hospital, were examined by direct, culture and molecular tests. Manual phenol-chloroform method was used in order to extract DNA. Specific primers of Aspergillus genus and beta-actin primers were used for duplex-PCR. A pairs of internal primers were utilized in order to identification of A.fumigatus (Nested-PCR method). Finally, some of the PCR-products were sequenced for confirming results. Results: Overall, 12 samples (12%) were aspergillus-positive by molecular test while 11% and 10% samples were positive by direct and culture test, respectively. The sensitivities and specificities of PCR method compare with direct examination was 100% and 98.8%, respectively. The study also showed that sensitivities and specificities of PCR method compare with culture was 100% and 97.7%, respectively. After sequencing PCR product sample, isolated species were recognized as A. fumigatus. Conclusions: This study showed that PCR method in compare with the direct method and the culture has a higher sensitivity in the detection of Aspergillus species, also Present study displayed that can be consider Aspergillus species and A. fumigatus in suspicious to tuberculosis BAL samples