شناسايي سريع باكتري ويبريو كلرا با استفاده از واكنش زنجيره‎اي پليمراز شش‎گانه (Hexaplex PCR)

Rapid Detection of Vibrio Cholerae Using Hexaplex PCR Assay

مقدمه: ويبريو كلرا (عامل بيماري وبا) يك پاتوژن مهم در بروز بيماري اسهال در بخش‌هاي گسترده‌اي از آسيا و آفريقا است. اين باكتري يك پاتوژن روده‌اي است كه مي‌تواند سبب بروز بيماري همه‌گير گردد. درنتيجه تشخيص سريع، حساس و اختصاصي ويبريو كلرا، مورد توجه اكثر آزمايشگاه‌هاي تشخيصي است. هدف از اين پژوهش، طراحي و توسعه يك روش سنجش سريع ژنوم باكتري ويبريو كلرا بر اساس واكنش زنجيره‌اي پليمراز شش‌گانه (Hexaplex PCR) است. مواد و روش‌ها: پرايمر جهت شناسايي شش ژن بيماري‎زا و تنظيمي از باكتري ويبريو كلرا انجام شد. ژن‌هاي مذكور شامل ژن‌هاي كلرا توكسين زير واحدهاي A و (ctxA, ctxB) B، توكسين zot، انتروتوكسين كلرا (ace)، توكسين تنظيمي (tcp) و پروتيين غشا خارجي (ompW) است. ژنوم نمونه استاندارد، با استفاده از پرايمرهاي مذكور در واكنش زنجيره‌اي پليمراز شش‌گانه، مورد مطالعه قرار گرفت. همچنين حساسيت و اختصاصيت سنجش مذكور نيز ارزيابي شد. يافته‌ها: انجام PCR شش‌تايي، حضور ژن‌هاي بيماري‌زا و تنظيمي باكتري ويبريو كلرا را در نمونه استاندارد نشان داد. همچنين نتايج بيانگر اختصاصيت مناسب روش بوده و حساسيت آن تا حدود cfu 100 از باكتري محاسبه گرديد. نتيجه‌گيري: از روش واكنش زنجيره‌اي پليمراز شش‌گانه مي‌توان براي طراحي كيت تشخيصي عامل بيماري وبا استفاده نمود.

Background: Vibrio cholerae is an important agent of diarrheal diseases in many parts of Asia and Africa. It is an enteric pathogen which produce a global pandemic of the disease. Rapid, sensitive and specific measurement of V. cholerae is an interest for many clinical laboratories. The aim of this study was to design and develop a hexaplex PCR assay for rapid detection of V. cholerae. Materials and Methods: Six pair of primers were designed for specific amplification of the virulence and regulatory genes for Vibrio cholerae O1: cholera toxin enzymatic subunit A (ctxA) and B (ctxB), zonula occludens toxin (zot), accessory cholerae enterotoxin (ace), toxin- coregulated pilus (tcp) and outer membrane protein (ompW). Hexaplex PCR carried out using six primers and standard genes. Moreover, sensitivity and specificity of this method were determined. Results: Hexaplex PCR showed the presence of the virulence and regulatory genes for Vibrio cholerae O1 in the standard sample. In addition, specificity was qualified and sensitivity determined 100 cfu/ml in this method. Conclusion: Hexaplex PCR Assay could be used to design a kit for cholerae detection.