زيرهمسانه‌سازي و بررسي بيان ژن صناعي ناحيه اتصالي نوروتوكسين بوتولينوم تيپ B (BD/B

Subcloning and Assessment of the Expression of Synthetic Botulinum Neurotoxin Type B Binding Domain (BD/B)

زمینه و هدف: سندرم بوتولیسم توسط نوروتوكسین باكتری كلستریدیوم بوتولینوم ایجاد می‌شود. این نوروتوكسین دارای 7 سروتیپ از A-G می‌باشد. بهترین راه برای جلوگیری از سندرم بوتولیسم ایجادشده توسط BoNT/B، استفاده از واكسن‌های نوتركیب ساخته‌شده از ناحیه اتصالی آن (به‌علت داشتن اپی‌توپ‌های كافی برای تحریك سیستم ایمنی) است. در این پژوهش بیان زیرواحد اتصالی نوروتوكسین بوتولینوم تیپ B، به‌منظور كاندید واكسن مورد بررسی قرار گرفت. روش بررسی: ابتدا توالی ژن ناحیه اتصالی نوروتوكسین بوتولینوم تیپ  Bاز سایت NCBI با كد دسترسی EF028399.1 گرفته شد. بعد از بهینه‌سازی كدون، ژن مورد نظر به‌صورت صناعی در داخل وكتور pUC18 تهیه گردید. سپس این ژن در وكتور بیانی pET32a(+) كه دارای ماركر انتخابی آمپی‌سیلین می‌باشد، زیرهمسانه‌سازی شد. جهت تأیید صحت زیرهمسانه‌سازی؛ از PCR، برش آنزیمی و تعیین توالی و برای بررسی بیان از سوش E. coli BL21(DE3) استفاده گردید. صحت بیان پروتئین با الكتروفورز (تحت شرایط مختلف و روش وسترن بلات) مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: واكنش‌های PCR، برش آنزیمی را براساس سایت‌های برشی در وكتور و در نهایت، تعیین توالی تأیید كرد كه ژن مورد نظر به‌طور مناسب در وكتور pET32a(+)، همسانه‌سازی شد. بررسی بیان با استفاده از SDS- PAGE و متعاقب آن انجام وسترن بلاتینگ نشان داد پروتئین مورد نظر در سویه بیانی مذكور بیان نمی‌شود. نتیجه‌گیری: اگرچه ژن مورد نظر در داخل وكتورpET32a(+)، به‌طور مناسب زیرهمسانه‌سازی گردید، با این حال هیچ بیان قابل‌مشاهده‌ای از ژن مورد نظر دیده نشد.

Background and Objectives: Botulism syndrome is caused by Clostridium botulinum neurotoxin. This neurotoxin has 7 serotypes, from A to G. The best way to prevent botulism syndrome caused by BoNT/B is immunization with recombinant binding domains of BoNT/B (due to containing sufficient epitopes to stimulate the immune system). In this study, the expression of the BoNT/B binding domain as a candidate vaccine, was investigated. Methods: At first, the sequence of the BoNT/B binding domain gene was obtained from NCBI website with accession number of EF028399.1. After codon optimization, the gene was synthesized in pUC18 vector. Then, the gene was subcloned in pET32a(+) expression vector that carries an ampicillin selection marker. PCR, enzymatic digestion, and sequencing were used to confirm subcloning accuracy, and E. coli BL21(DE3) was used for the expression analysis. The accuracy of protein expression was evaluated by electrophoresis and western blotting. Results: PCR reaction, enzymatic digestion, and sequencing confirmed that the gene of interest has been subcloned appropriately in the vector. The expression analysis by SDS-PAGE and subsequently western blotting, showed that the protein of interest is not expressed in the mentioned expression strain. Conclusion: Although the gene was successfully subcloned in pET32a(+) vector, no significant expression of the gene was observed.