همسانه سازي و بيان ايمونوتوكسين نوتركيب با استفاده از توكسين ديفتري و فاكتور محرك رشد كلني گرانولوسيت

Cloning and Expression of Recombinant Immunotoxin using Diphtheria Toxin and Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)

زمينه و هدف: ايمونوتوكسين يك توكسين هدف‌مند است كه از اتصال دو بخش مجزا (بخش ايمني و بخش توكسيني) با واسط شيميايي يا پپتيدي اختصاصي تشكيل مي‌شود. هدف اصلي تحقيق حاضر توليد پروتيين هيبريدي و نوتركيب مشتمل بر توكسين ديفتري و فاكتور محرك رشد كلني گرانولوسيتي است. مواد و روش ها: با توجه به ساختار اولين ايمنوتوكسين تجاري نوتركيب (اونتاك، پروتيين هيبريدي شامل توكسين ديفتري و اينترلوكين 2)، ژن به رمزدرآورنده توكسين ديفتري (DT) و فاكتور محرك رشد كلني گرانولوسيت (G-CSF) با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و قالب پلاسميدي pET-IDZ3 (پلاسميد pET21 حاوي ژن رمز كننده ايمونوتوكسين اونتاك) و pET-GCSF (پلاسميد pET23 حاوي ژن رمز كننده G-CSF) تكثير يافت. سپس اتصال دو قطعه ژني با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و در طي روش Soeing PCR انجام شد. در ادامه، قطعه ژني هيبريدي درون وكتور (+) pET21a منتقل گرديد تا سازه ژني pET-DT-GCSF به دست آيد. ساخت اين سازه ژني از طريق توالي يابي، SDS-PAGE و وسترن بلات مورد تاييد قرار گرفت. يافته‌ها: ژن به رمز درآورنده ايمونوتوكسين نوتركيب بين جايگاه‌هاي آنزيمي EcoRI و NdeI درون وكتور (+) pET21a به صورت صحيح كلون گرديد و توليد سويه مولد ايمونوتوكسين نوتركيب DT-GCSF با استفاده از روش‌هاي مرسوم مورد تاييد قرار گرفت. نتيجه‌گيري: سيتوكين هيبريد پروتيين، DT-GCSF، مي‌تواند در راستاي مقابله با سلول‌هاي سرطاني و مهار آن‌ها كه در سطح سلولي آن‌ها گيرنده‌هاي G-CSF زياد بيان مي‌شوند، مورد استفاده قرار گيرد.

Background: Immunotoxin (IT) is a directed toxin containing two distinct sections (immune and toxin parts) covalently bond using specific chemical or peptide linkers. The aim of this study is to produce a recombinant and hybrid protein containing diphtheria toxin (DT) and granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). Materials and Methods: According to the structure of the first commercial recombinant immunotoxin (Ontak, hybrid protein containing DT fused interlukine2), gene encoding of DT and G-CSF was amplified using specific primers and plasmid template of pET-IDZ3 (pET21 harboring the gene encoding ontak immunotoxine) and pET-GCSF (pET23 harboring G-CSF), respectively. The DT-GCSF fusion protein produced using soeing PCR and specific primers. Finally, pET-DT-GCSF construction prepared using subcloning of DT-GCSF into pET21a(+) and confirmed by sequencing, SDS-PAGE and western blot technique. Results: Gene encoding of DT-GCSF inserted into NdeI/EcoRI site of pET21 and the construction of strain producing DT-GCSF recombinant immunotoxin was confirmed using customary methods. Conclusion: The cytokine fusion protein, DT-GCSF, could be used for the inhibition of G-CSF receptor bearing cancer cells.