Author/Authors :
بزرگخو، زهرا نويسنده Department of Microbiology, Islamic Azad University, Karaj Branch, Karaj, Iran Bozorgkhoo, Z. , پيله چيان لنگرودي، رضا نويسنده , , خاكي، پژواك نويسنده , , جباري، احمد رضا نويسنده بخش تحقيق و توليد واكسن‌هاي بي‌هوازي, موسسه تحقيقات واكسن وسرم سازي رازي، كرج، ايران Jabbari, A.R. , مرادي بيدهندي، سهيلا نويسنده Department of Microbiology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Iran Moradi Bidhendi, S. , موسوي شوشتري، محسن نويسنده موسسه تحقيقات واكسن و سرم سازي رازي, ,
Abstract :
كلستريديوم سپتيكوم يك باكتري گرم مثبت بي هوازي است كه تعدادي توكسين از جمله آلفا، بتا، گاما و دلتا را توليد مي كند. آلفا توكسين كلستريديوم سپتيكوم كشنده بوده و مسيول بيماري بسيار خطرناك قانقراياي گازي است. هدف مطالعه حاضر كلونينگ ملكولي و توالي يابي ژن آلفا توكسين كلستريديوم سپتيكوم سويه واكسينال(CN913) است. از سوسپانسيون كشت شبانه باكتري، DNA ژنوميك به وسيله روش استاندارد فنل كلروفرم تخليص و ژن آلفا توكسين با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي طراحي شده و به روش واكنش زنجيره اي پليمراز تكثير شد. كمّيت و كيفيت محصول واكنش زنجيره اي پليمراز با استفاده از الكتروفورز ژل آگارز تعيين و به روش اسپكتروفوتومتري تاييد گرديد. محصول واكنش زنجيره اي پليمراز تخليص ودر وكتوركلونينگ pJET1.2blunt لايگيت شد. سپس سلول مستعد E. coli/TOP10 به وسيله آن ترانسفورم گرديد. پلاسميد نوتركيب pJET?sep از كلونE. coli/TOP10/pJET?sep تخليص و ژن آلفا توكيسن به وسيله پرايمرهاي يونيورسال توالي يابي شد. توالي يابي و آناليز بلاست ژن csa بيش از 99% تشابه را با ساير ژنهاي csa موجود در بانك ژن نشان داد. اين توالي با شماره JN793989 در بانك ژن ثبت گرديد. از سويه E. coli/TOP10/pJET?sep مي توان به عنوان يك كلون نوتركيب باكتريايي براي تخليص ژن csa و بيان آن در ميزبان مناسب استفاده نمود.
Abstract :
Clostridium septicum a Gram positive anaerobic bacterium produces several toxins including alpha, beta, gamma and delta. C. septicum alpha toxin is lethal and is responsible for a serious disease known as gas gangrene. The aim of the present study was to molecular cloning and sequencing of C. septicum vaccine strain alpha toxin gene. Genomic DNA was extracted using standard phenol and chloroform extraction method, and the target gene was amplified through PCR by specific primers. Quality and quantity of PCR product was evaluated using agarose gel electrophoresis and confirmed with spectrophotometry. The PCR product was purified and was ligated in pJET1.2blunt cloning vector and was used for E. coli/TOP10 competent cells transformation. pJET?sep recombinant plasmid was purified and sequenced using universal primers. Sequencing and BLAST analysis of csa showed over 99% identity to other previously deposited csa in the GenBank. The csa sequence was deposited in the GenBank under accession number JN793989. E. coli/TOP10/pJET?sep as a recombinant bacterium could be used for purifying of recombinant csa gene and its expression in the suitable prokaryotic hosts.
