Construction of an iss deleted mutant strain from a native avian pathogenic Escherichia coli O78: K80 and in vitro serum resistance evaluation of mutant

زمينه مطالعه: كلي باسيلوز يكي از بيماريهاي مهم در صنعت طيور است. سروتيپ ‌78O اشريشياكلي‌ ‌بيماريزاي طيور ‌)78(APEC-O شايع‌ترين عامل اين بيماري در ايران است. از جمله عوامل حدت‌ ‌اشريشياكلي‌ ‌بيماريزاي طيور، ژن افزايش دهنده بقاي سرمي ‌(iss)‌ است كه در مقاومت به سرم نقش دارد. مقاومت به سرم يكي از رهيافت‌هاي سيستميك شدن اشريشياكلي‌ ‌بيماريزاي طيور مي‌باشد. با توجه به اين كه غالب‌ترين شكل باليني كلي باسيلوز طيور به صورت خارج روده‌اي مي باشد و احتمالاً اين فرم از بيماري به مقاومت سرمي باكتري ارتباط دارد، در نتيجه به نظر مي‌رسد كه احتمالاً با حذف ژن iss رهيافتي در كنترل بيماري كلي باسيلوز ايجاد گردد. علاوه بر اين، اطلاعات كمي در مورد مكـانيسـم مقـاومـت سـرمي 78APEC-O وجود دارد. هدف: در مطالعه حاضر، سويه موتان با حذف ژن iss از سويه بومي (‌1378‌)c اشريشياكلي‌ ‌بيماريزاي طيور ‌78O ايجاد گرديد و سويه موتان از نظر مقاومت به سرم با سويه وحشي مورد ارزيابي قرار گرفت. روش كار:‌ ‌در اين مطالعه، سيستم lambda red recombinase براي حذف ژن iss در سويه بومي (1378‌)c اشريشياكلي‌ ‌بيماريزاي طيور ‌78O مورد استفاده قرار گرفت. ابتدا پلاسميد 46pKD ‌(توليد كننده آنزيم‌هاي سيستم )lambda red recombinase ‌ و سپس محصول PCR كه داراي توالي مشابه اطرافي با ژن iss و نشانگر مقاومت به كانامايسين بود به داخل سويه بومي (1378‌)c اشريشياكلي‌ ‌بيماريزاي طيور ‌78O ترانسفورمه گرديد. حساسيت به سرم نيز به روش ميكروتيتر در سويه وحشي و موتان مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج: ‌نتايج نشان داد كه سويه جهش يافته با موفقيت ايجاد شده و به جاي ژن iss، كاست مقاومت كانامايسين جايگزين شد. همچنين، اگرچه، سويه موتان به سرم حساس بــود امــا تـفــاوت مـعـنـي‌داري از نـظـر مقـاومـت بـه سـرم بيـن سـويـه مـوتـان و وحشـي وجـود نـداشـت. نتيجـه‌گيـري‌نهـايـي: روش lambda red recombination به عنوان يك روش ساده و مفيد براي حذف ژن قابل استفاده است. همچنين احتمالاً ژن‌هاي ديگري در جبران فعاليت ژن iss نقش دارند.

BACKGROUND: Colibacillosis, caused by different serotypes of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), is one of the important diseases in poultry industry. The isolate O78 is the most prevalent serotype of APEC in Iran. One of the APEC virulence factors, increased serum survival (iss) gene, is related to serum resistance. The usual form of colibacillosis in avian is extraintestinal, and serum resistance is applied one way by APEC to reach internal organs; hence, it appears that the control of colibacillosis in poultry regarding the deletion of iss and the construction of a serum sensitive APEC strain is beneficial. Additionally, the knowledge about APEC serum resistance could be extended using mutant strains. OBJECTIVES: The present study was an attempt to generate an iss mutant strain from native APEC-O78 strain |c|1378 and to study the level of serum resistance of native APEC-O78 strain c1378 in comparison with its mutant (APEC-O78 strain c1378|D|iss). METHODS: The lambda red recombinase system was utilized to delete iss gene in native APEC-O78 strain c1378. This strain was first transformed with the plasmid pkD46 to introduce the lambda red recombinase system and then the PCR product with sequence homology to the iss gene and a kanamycin resistance marker was transformed into the APEC-O78 strain c1378. Serum sensitivity of mutant and wild type strain was investigated by microtiter test. RESULTS: The generation of mutant was successful and the iss was replaced with kanamycin resistance cassette. Also, it was observed that the mutant was sensitive to serum. However, serum sensitivity of iss deleted mutant was not statistically different from its parents. CONCLUSIONS: Application of lambda red recombination could be a simple and useful technique for production of a precisely defined gene deletion. Also, there may be some genes that compensate the activity of iss gene.