Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) by vector containing human pro-insulin gene

انتقال ژن‌هاي خارجي به قارچ‌هاي خوراكي با استفاده از Agrobacterium tumefaciens روشي متداول در مهندسي ژنتيك محسوب مي‌شود. براي درمان ديابت نوع يك به ‌طور عمده از انسولين نوتركيب استفاده مي‌شود. توليد پروانسولين در قارچ‌هاي خوراكي مي‌تواند سبب تسهيل در تحويل خوراكي اين دارو شود. در اين مطالعه از باكتري A. tumefaciens براي انتقال و بيان ژن تركيبي زير واحد سم وبا و پروانسولين انساني (CTB-Pins) در قارچ صدفي Pleurotus ostreatus استفاده شد. براي اين‌منظور ناقل بياني pCAMBIA1304 حاوي ژن CTB-Pins تحت كنترل پيشبرنده gpd قارچ صدفي طراحي و با استفاده از روش انتقال ژن مبتني بر A. tumefaciens به قارچ P. ostreatus منتقل شد. بهينه‌سازي شرايط انتقال ژن و كشت بافت از عوامل مهم در توليد قارچ تراريخت به‌شمار مي‌آيند. براي اين‌منظور، شرايط هم‌كشتي قارچ و باكتري، سويه‌ اگروباكتريوم و غلظت آن مورد مطالعه قرار گرفت. انتقال ژن CTB-Pins به قارچ صدفي با استفاده از آزمون PCR تاييد گرديد. انتقال موفق ژن به قارچ صدفي بيانگر روشي مفيد براي توليد پروانسولين انساني در قارچ‌هاي خوراكي مي‌باشد.

Transferring foreign genes into mushroom mediated by Agrobacterium tumefaciens is a standard technique in genetic engineering. Recombinant human insulin has been greatly used in the treatment of type I diabetes. The production of edible mushroom derived insulin should facilitate oral delivery. In this study we used the Agrobacterium tumefaciens mediated transformation method for the transfer and expression of the cholera toxin-B subunit (CTB) fused with human pro-insulin (Pins) in the edible oyster mushroom, Pleurotus ostreatus. The binary vector pCAMBIA1304 harboring CTB-Pins gene driven by the P. ostreatus gpd promoter was constructed and introduced into P. ostreatus via Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Optimization of gene transformation and tissue culture conditions is one of the most important issues in transgenic mushroom production. For attaining optimized conditions, the effects of co-cultivation conditions, Agrobacterium strains and the concentration of Agrobacterium cell suspensions were studied. Integration of CTB-Pins into mushroom genome was confirmed by PCR. The successful transformation to oyster mushroom suggests that the proposed modified transformation system is apparently useful for the production of human pro-insulin in these edible mushrooms.