Construction of a recombinant vector for site-directed mutagenesis in Salmonella typhimurium

زمينـه» مطالعه: ‌در بين همه تكنيك‌هاي رايج براي جهش زايي هدفمند از سيستم Red recombinase l به طور گسترده‌اي براي غيرفعال كردن ژن‌هاي كروموزومي در باكتري‌ها استفاده شده است. در اين روش هميشه خطر تجزيه DNA خطي وارد شده توسط آنزيم هاي محدود الاCثر وجود دارد كه سبب كاهش فركانس نوتركيبي مي شود. هدف:‌ ‌براي رفع اين مشكل ما يك وكتور نوتركيب براي غيرفعال كردن ژن phoP در سالمونلا تيفي موريوم‌ ‌ساختيم. روش كار: ‌به منظور ساخت اين وكتور از SOEing PCR و آنزيم هاي محدودالاCثر استفاده شد. نتـايـج: پلاسميـد حـاصـل،‌92pTAAZ، حـاوي يـك كـاسـت كـانـامـايسيـن با دو بازوي طويل هومولوگ مجاور ژن phoP مي‌باشد. نتيجه‌گيري‌‌نهايي: با الكتروپوريشن ‌92pTAAZ به سالمونلا تيفي موريوم كاست كانامايسين از طريق نوتركيبي همولوگ جايگزين ژن phoP مي‌شود. با توجه به هومولوژي زياد ژن phoP در بسياري از گونه‌هاي‌ ‌سالمونلا‌ ‌مي توان از اين پلاسميد براي حذف ژن phoP در اكثر اين گونه‌ها استفاده نمود.

Background: Among all common techniques in site-directed mutagenesis, l Red recombinase system has been widely used to knock out chromosomal genes in bacteria. In this method, there is always the risk of DNA Linear digestion by hostʹs restriction enzymes that leads to the low frequency of recombination. OBJECTIVES: To overcome this, we constructed a recombinant vector to disrupt phoP gene in Salmonella typhimurium. METHODS: The SOEing PCR method and restriction enzymes were used to construct the vector. RESULTS: The resulting plasmid, pTAAZ92, contains a Kanamycin cassette with two long homologous arms flanking of the phoP gene. CONCLUSIONS: After electrotransformation of the pTAAZ92 into the Salmonella typhimurium , the phoP gene is replaced by the Kanamycin cassette through homologous recombination. According to the high homology of the phoP gene in many of Salmonella species the pTAAZ92 can be used to disrupt the phoP gene in most of these species.