Absolute quantification of murine interleukine-4, interleukine- 10 and interferon-γ gene transcripts using Real Time PCR

مطالعه بيان سايتوكاينها در شرايط مختلف سـ?مت و بيمــاري و براي ارزيابي پاسخهاي ايمني واكسنهاي جديد بسيار مهم است. كميت سنجي مطلق مبتني بر رسم نمودار كاليبراسيون و توليد كنترل هاي استاندارد ميباشد تا نتايج قابل اعتمادتري نسبت به سيستم هاي نسبي داشته باشد. در اين مطالعه سه كنترل استاندارد براي سايتوكاينهاي اينترلوكين 10، اينترلوكين4 و اينترفرون گاما به منظور انجام روش كميت سنجي مطلق در مدل موشي ساخته شد. در اين پژوهش تعداد 10 موش نژاد Balb/C با مايع كيست هيداتيك همراه با اجووان فروند بطور زير جلدي سه بار با فاصله دو هفته به منظور القا سلولهايTh1، Th2ايمن شدند. سه جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير اينترلوكين 4، اينترلوكين10 و اينترفرون گاما با استفاده از نرم افزار اوليگو طراحي شد. توالي هاي تكثير شده از سه سايتوكاين دروكتور pTZ57R-T كلون شدند . پلاسميدهاي نوتركيب حاوي توالي هاي مورد نظر خالص شده و رقت هاي سريالي از آنها تهيه شد. واكنش Real time PCR در حضور سايبر گرين انجام شده نمودر استاندارد با نرم افزار7500 ABI SDS بر اساس غلظتهاي سريال پلاسميدهاي نوتركيب ترسيم شد. نتايج اين مطالعه نشان داد كه اين تست براي اندازه گيري ميزان ترنسكريپشن سه سايتوكاين مورد مطالعه تا رقت كمتراز 0.01 پيكوگرم (حدودا 150 كپي) با راندمان بالا ميتواند كارامد باشد. اين تكنيك امكان بررسي كمي سايتوكاين هاي بيان شده بواسطه القا آنتي ژن را فراهم مي كند.

The study of cytokines gene expression is quite important in various conditions of health and disease for the evaluation of clinical responses to new vaccination approaches. An absolute quantification is based on a calibration curve and production of standard controls to achieve more reliable results than in relative system. In this study we attempted to construct standard controls to evaluate the murine immune response. The number of 10 Balb/c mice immunized with hydatid cyst fluid subcutaneously with two week intervals to induce transcription of Th1 and Th2 related cytokines. Three Pairs of primers were designed to amplification of interleukine-4, interleukine-10 and interferon-? by Oligo software. Partial sequences of three cytokine genes were cloned into pTZ57T vector. Three recombinant plasmids were purified and serial dilutions were prepared. Real time qPCR carried out using SYBR-Green I fluorescence dye and standard curves were provided by the 7500 ABI SDS software based on the exact concentration of dilutions and the amplification plots. Results showed that this method was able to evaluate the cytokines mRNA levels less than 0.01pg (~150 copy). We concluded that absolute real-time qPCR can be successfully applied to the quantification of antigen-induced cytokines.