Identification of shiga toxin producing Escherichia coli O157:H7 in raw cow milk samples from dairy farms in Mashhad using multiplex PCR assay

در اين بررسي، در طول ماه‌هاي تابستان به صورت تصادفي 130 نمونه شير خام از تانکرهاي شير که به کارخانه شير پگاه تحويل داده مي‌شد نمونه‌گيري گرديد. جهت جداسازي باکتري اشريشيا کلي O157:H7 نمونه‌ها ابتدا در محيط آبگوشت تريپتيک سوي حاوي نووبيوسين غني‌سازي گرديد و سپس در محيط آگار انتخابي CT-SMAC حاوي سيفيکسيم و تلوريت پتاسيم کشت داده شد. کلني‌هاي غير تخمير کننده سوربيتول (NSF) با استفاده از آزمايش‌هاي بيوشيميايي (IMViC) به عنوان اشريشيا کلي مورد تاييد قرار گرفتند، سپس به روش PCR چندگانه (m-PCR) و با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي ژن کد کننده آنتي‌ژنهاي O157 و H7 و پس از آن پرايمرهاي اختصاصي ژن‌هاي stx1 و stx2 مورد آزمايش قرار گرفتند. در اين مطالعه 8 نمونه کلني‌هاي اشريشيا کلي NSF جداسازي گرديد. در آزمايش m-PCR يک (77/0%) نمونه آلوده به سروتيپ O157:H7 تشخيص داده شد و در آزمايش m-PCR دوم مشخص گرديد که باکتري جداسازي شده حاوي ژن stx2 مي‌باشد. روش مورد استفاده مي‌تواند به عنوان روش جايگزين روش‌هاي ايمونولوژيک که حضور آنتي‌ژنهاي سوماتيک و تاژک را مورد شناسايي قرار مي‌دهند مطرح باشد و علاوه بر آن توان توکسين زائي آن‌ها را نيز مشخص مي‌نمايد.

In this study 130 bulk tank milk samples which were delivered to the Pegah Pasturisation Factory in Mashhad were collected randomly during the summer months. Samples were firstly enriched in modified trypticase soy broth containing novobiocin, followed by plating onto sorbitol MacConkey agar supplemented with cefixime and potassium tellurite for isolation of Escherichia coli O157:H7. Consequently the suspected non-sorbitol fermenting (NSF) colonies were confirmed by biochemical tests as Escherichia coli and then were used for multiplex-PCR assay, using primers specific for O157 and H7 antigens genes and then primers specific for stx1 and stx2 genes. NSF Escherichia coli colonies were recovered from 8 samples, and in multiplex-PCR assay one sample (0.77%) was confirmed as Escherichia coli O157:H7. The second multiplex PCR assay showed that the isolate was harboring the stx2 gene. The PCR assay used in this study may be a possible alternative to immunological assays which detect somatic and flagellar antigens. Besides, this procedure determines the potential of isolates for toxin production.