Construction of a human recombinant polyclonal Fab fragment antibody library using peripheral blood lymphocytes of snake bitten victims

مسموميت ناشي از مارگزيدگي در انسان در بسياري از كشورهاي گرمسيري و نيمه گرمسيري يك تهديد جدي محسوب مي گردد. بهترين درمان قابل قبول براي اشخاص مارگزيده استفاده از پادزهرها مي باشد. با اين حال اين پادزهرها بدليل يكسري مشكلات اقتصادي و پزشكي نياز به بهبود بيشتري دارند. در اين تحقيق، يك كتابخانه ژني تركيبي انساني برعليه تعدادي از مارهاي زهري ايراني ساخته شده است. RNA تام از لنفوسيتهاي خون محيطي دو نفر از مصدومين مارگزيده بهبود يافته تهيه شد. از روش واكنش زنجيره اي پليمراز ترنس كريپتاز معكوس براي ساخت cDNA و ازدياد زنجيره هاي سنگين(Fd) و سبك كاپاي ايمونوگلوبولين جي استفاده شد. بعد از هضم زنجيره Fd با آنزيمهاي SpeI و XhoI و همچنين زنجيره كاپا با آنزيمهاي XbaI و SacI، اين زنجيره ها به طور پشت سرهم به داخل حامل pComb3x كلون شدند و سپس براي ساخت كتابخانه فب، اين حاملهاي نوتركيب به داخل باكتري تي جي يك رانده شدند. براي تعيين تعداد وكتورهاي حاوي قطعه فب، پلاسميدهاي دوازده پرگنه كتابخانه استخراج و بعد با آنزيم SfiI هضم گرديدند. طول زنجيره هاي Fd و كاپاي تكثير شده 650 تا 750 جفت باز بود. تعداد اعضاي اوليه كتابخانه 105×9/4 تعيين گرديد كه نيمي از آنها حاوي قطعه اي به اندازه قطعه فب بودند. اين نتيجه، با نتيجه تحقيق بعضي از محققين ديگر مشابهت داشته و نشان مي دهد كه اين روش مي تواند اسباب مناسبي براي توليد قطعه فب آنتي بادي پري كلونال انساني براي استفاده در درمان مصدومين مارگزيده باشد.

Human snake bitten poisoning is a serious threat in many tropical and subtropical countries such as Iran. The best acceptable treatment of envenomated humans is antivenoms; however they have a series of economic and medical problems and need more improvements. In this study a combinatorial human immunoglobulin gene library against some of Iranian snakes venoms was constructed. Total RNA prepared from peripheral blood lymphocytes of two recovered snake victims. RT-PCR was used for cDNA synthesis and amplification of the heavy (Fd segment) and kappa light chains of IgG antibody. After digestion of the heavy chain with SpeI and XhoI and light chain with XbaI and SacI enzymes, inserted successively into the cloning vector pComb3x, and then recombinant vector transformed to TG1 bacteria to construct the Fab library. For determination insertion rate of Fab segment into cloning vector, plasmids of 12 clones of library were extracted and digested with SfiI. Length of amplified Fd and ? chains, were 650 - 750 bp. Primary library size was determined to contain 4.9×105 members out of which half of them contained the same size of Fab fragment. This result is comparable to some researchers and shows that this method could be appropriate tool for the production of human polyclonal Fab fragment antibodies for management of poisonous snake bitted victims.