اختلال ژني در سالمونلا تيفي موريوم به روش λ red disruption تغيير يافته

تكنيك‌هاي زيادي براي غير فعال كردن هدفمند ژن‌ها در باكتري‌ها وجود دارد كه بعضي از آن‌ها در گونه‌هاي سالمونلا به كار برده شده است. در اين مطالعه تركيبي از SOEing PCR method و λ red disruption system براي حذف ژن phoP در سالمونلا تيفي موريوم بومي و استاندارد استفاده شد. سه واكنش استاندارد واكنش زنجيره‌اي پليمراز و يك واكنش فيوژن واكنش زنجيره‌اي پليمراز براي ساخت يك DNA خطي شامل بالادست و پايين دست ژن phoP و كاست كانامايسين انجام شد. به عنوان پلاسميد الگو از پلاسميد pKD4 استفاده شد كه داراي ژن مقاومت به كانامايسين با نواحي FRT (جايگاه شناسايي FLP) در دو طرف مي‌باشد. محصول خطي به دست آمده به سلول‌هاي صلاحيت‌دار سالمونلا تيفي موريوم الكتروپوريت شد. فقط تعدادي كلني مربوط به سويه استاندارد ترانسفورمه روي LB آگار كانامايسين‌دار مشاهده شد و هيچ كلني مربوط به سويه بومي بر روي اين محيط پديدار نشد. عدم موفقيت در ترانسفورمه كردن سويه بومي ممكن است به دليل عدم سازگاري سيستم λ red disruption در اين سويه و يا سيستم‌هاي restriction modification ناشناخته باكتري بومي مورد آزمايش باشد. با اين حال با استفاده از اين محصول خطي مي‌توان از گونه‌هاي مختلف سالمونلا سويه‌هاي موتان phoP به دست آورد كه اين به دليل همولوژي زياد اين ژن در انواع سالمونلا مي‌باشد.

There are many techniques to knock out directed genes in bacteria, some of which have been described in Salmonella species. In this study, a combination of SOEing PCR method and the λ Red disruption system were used to disrupt phoP gene in wild type and standard strains of Salmonella typhimurium. Three standards PCR and one fusion PCR reactions were performed to construct a linear DNA including upstream and downstream of phoP gene and Kanamycin cassette. As a template plasmid, we used pKD4 whichcarries kanamycin gene flanked by FRT (FLP recognition target) sites. The resulting construct was electroporated into prepared competent cells of S. typhimurium. The transformants colonies related to the standard strain appeared on the LB Km agar plates after incubation, but there was no colony on LB Km agar plates corresponding to the wild type strain. The failure in transformation of the wild type strain may be because of inflexibility of the λ Red disruption system in this strain or its unique restriction modificationsystem. However, by this construct we are able to generate phoP mutant in many of the Salmonella species due to high homology of the phoP gene which exists in different species.