روش‌هاي تشديد كننده انتقال ژن به اسپرم گوسفند

انتقال ژن به واسطه اسپرم مي‌تواند يك روش ساده و ارزان براي توليد جانوران تراريخته باشد، اما كارايي اين روش هنوز پايين است كه مي‌تواند به علت ورود مقدار ناكافي DNA خارجي به اسپرم باشد. هدف از اين مطالعه بررسي روش‌هاي تشديد كننده جذب DNA خارجي توسط اسپرم گوسفند مانند ليپوفكشن، انجماد سريع و تيمار با تريتون X100 و DMSO در ميزان جذب و تحرك اسپرم‌هاي داراي جذب بود. در آزمايش اول اسپرم گوسفند با كمپلكسي از مقادير مختلف پلاسميد نشاندار شده با ماده فلورسنت رودآمين و ليپوفكتامين2000 گرمخانه‌گذاري شدند. در آزمايش دوم اسپرم‌ها با تريتون X100 يا دي متيل سولفوكسايد منجمد شدند. نتايج نشان داد كه ميزان ترانسفكشن در گروه ليپوزوم/DNA 100 نانوگرم كمتر از گروه بدون ليپوزوم بود اما در گروه‌هاي 300 و600 نانوگرم اختلاف معني‌داري وجود نداشت. در شدت جذب و تحرك نيز اختلاف معني‌داري بين گروه‌هاي مختلف وجود نداشت. همچنين هيچ كدام از اسپرم‌هاي داراي جذب DNA خارجي، متحرك نبودند. لذا انتقال با واسطه ليپوزم باعث بهبود ميزان ترانسفكشن نشد. همه اسپرم‌هاي تيمار شده با تريتون X100 و منجمد شده پلاسميد نشان‌دار را به خود جذب كرده بودند اما همه آن‌ها بي حركت بودند. در اسپرم‌هاي تيمار شده با دي متيل سولفوكسايد با غلظت نهايي 1/0%، ميزان جذب نسبت به گروه شاهد به طور معني‌داري (P<0.05) بيشتر بود (40/69% در مقابل 80/57%). ميزان تحرك در گروه تيمار و گروه شاهد اختلاف معني‌داري نداشت. نتيجه آن كه استفاده از ليپوفكتامين نتوانست نه ميزان ترانسفكشن را بهبود بخشد و نه اسپرم‌هاي ترانسفكت شده متحرك توليد كند. اگر تيمارهاي تخريب كننده غشاء مثل انجماد و تيمار با تريتون X100 به هسته اسپرم صدمه نزنند، اين اسپرم‌ها مي‌توانند بدون نياز به انتخاب جهت تزريق داخل سيتوپلاسمي اُاُسيت استفاده شوند.

Sperm mediated gene transfer can be an inexpensive and simple method in animal transgenesis however its efficiency is poor, mainly due to the spermatozoa’s lesser uptake of exogenous DNA. In the present study, the effects of lipofection and other augmentation techniques, such as sperm freezing and spermatozoa treatment with triton X100 and DMSO, on exogenous DNA uptake by sheep spermatozoa and motility of sperms with plasmid uptake were evaluated. In the first experiment, ram sperms were incubated with a complex of rhodamine labeled plasmid (pEGFP) and Lipofectamine 2000TM. In the second, spermatozoa were treated with Triton X100TM or DMSO or were frozen without cryoprotectant. The results indicated that there was no significant difference (P<0.05) in the transfection rates and in the uptake intensity of lipofected sperms with 300 and 600 ng of plasmid in comparison with control group, i.e. transfected without lipofectamine. Furthermore, lipofection could not improve sperm motility during true plasmid uptake. Almost all of triton X100 treated and frozenthawed spermatozoa had absorbed foreign DNA, though all were immotile. In spermatozoa treated with 0.1% DMSO, plasmid absorption rate (69.40%) was significantly higher (P<0.05) than untreated spermatozoa (57.80%), but sperm motility was not significantly different from control group. In conclusion, lipofectamine® 2000 could neither improve transfection rate, nor support motility in transfected sperms. The methods inducing membrane disruption like, freezethaw and triton X100 treatment, can be used in ICSIsperm mediated gene transfer without the need for sperm selection, provided that they cause no damage to sperm nucleus.