طراحي و ساخت كاست ژني ctxB-gfp-stxB و بررسي بيان آن در E. coli سويه ( Bl21 (DE3

زمينه و هدف پروتئين هاي نوتركيب كايمريك، به منظور افزايش بيان پروتئين هاي محلول، تسهيل در تخليص آن ها و توليد پلي پپتيد چند منظوره، ابداع شده اند. هدف از اين تحقيق، ساخت كاست ژني ctxB -gfp-stxB و بررسي بيان آن به منظور بررسي ميزان جذب و دفع آنتي ژن الحاقي در مطالعات بعدي مي باشد. مواد و روش ها پس از تهيه پرايمر هاي مورد نياز براي ژن هاي gfp به عنوان ژن گزارشگر، ctxB و stxB، از تكنيك PCR براي تكثير ژن ها استفاده شد. ژن هاي تكثير شده، در وكتور pGEM، همسانه سازي و پس از تاييد قطعات ژني به ترتيب ctxB –gfp-stxB به يكديگر ممزوج شدند. سپس، كاست ژني ساخته شده، در وكتور بياني pET28a(+) هم سانه سازي شد. باكتري E. coli سويه (DE3 (Bl21، توسط وكتور نوتركيب، ترانسفورم شد و بيان پروتئين، تحت القاي IPTG و الكتروفورز SDS-PAGE ارزيابي شد. نتايج ژن هاي تكثير شده در وكتور pGEM، همسانه سازي شدند و كلون ها به كمك سه روش PCR، هضم آنزيمي و توالي يابي، تاييد شدند. قطعات ژني تاييد شده به ترتيب ctxB -gfp-stxB به يكديگر ممزوج شد. پس از زيرهمسانه سازي، وجود كاست ژني ساخته شده به روش هضم آنزيمي تاييد شد. براي اين كاست ژني، در E. Coli سويه Bl21(DE3)، بياني مشاهده نشد. نتيجه گيري تعداد زياد كدون هاي نادر در ژن هاي stxB و ctxB، باعث عدم بيان كاست ژني در E. coli شد. بنابراين، براي دستيابي به بيان و بهينه سازي آن، يافتن ميزباني مناسب، ضروري است. با توجه به ساختار كاست ژني و جايگاه آنزيم هاي محدودالاثر بر روي قطعه ساخته شده، ژن هاي مختلف را مي توان جايگزين نموده و قطعات متنوع ژني توليد نمود.