Fusion of Clostridium perfringens type D and B epsilon and beta toxin genes and it’s cloning in E. coli

طراحي و توليد صحيح و مناسب يك ساختار فيوژن؛ از مهمترين مشكلات در زمينه توليد مقادير زياد پروتيين هاي فانكشنال برخوردار از پيچ خوردگي‌هاي مناسب است. چنين ساختاري بايد داراي كليه اجزاي مورد نياز يك ژن واقعي باشد. در صورتيكه ساختار فيوژن به خوبي طراحي شده باشد, مي توان آن را در داخل يك ميزبان مناسب كلون كرد. كلستريديوم پرفرينجنز از عوامل مهم بيماري‌زاي انسان و دام بوده و تعداد زيادي توكسين از جمله اپسيلون و بتا كه مسيول بيماري هاي شديدي هستند را توليد ميكند. در مطالعه حاضر يك ساختار جديد شامل partial cds ژن توكسين اپسيلون كلستريديوم پرفرينجنز تيپ D و partial cds ژن توكسين بتا كلستريديوم پرفرينجنز تيپ B طراحي شد. در اولين مرحله اين ژن ها با استفاده از دو جفت پرايمر آمپليفاي شده و در مرحله دوم با استفاده از پرايمرهاي اپسيلون فوروارد و بتا ريورس و با بكار گرفتن قطعه AEAAAKEAAAKAبه عنوان لينكر با يكديگر فيوز شدند. اين كار بر مبناي روش fusion PCR وبا استفاده از آنزيم DNA Pfu پليمراز كه قابليت تصحيح خطا را دارد انجام شد. قطعه فيوژن پس از اينزرت شدن در پلاسميد pJET1.2blunt در باكتري E.coli سويه TOP10 كلون شد. براساس آخرين اطلاعات موجود اين مقاله اولين گزارش در خصوص طراحي و كلونينگ فيوژن ژن اپسيلون- بتا و اولين گزارش در مورد استفاده از استراتژي فيوژن واكنش زنجيره‌اي پليمراز در كلستريديا است كه مي‌تواند براي توسعه و تكوين يك واكسن نوتركيب از فيوژن پروتيين اپسيلون-بتا استفاده شود. همچنين اين ساختار مي تواند به عنوان مدلي براي توسعه و تكوين ساختار هاي جديد فيوژن پروتيين براي ساير پروتيين ها و توكسين‌هاي بالقوه نيز بكار گرفته شود.

Designing and producing a proper fusion construction is the most important problem of producing large quantities of a properly folded functional protein. This construction should have all necessary components of a real gene. A good designed fusion gene construction could be cloned into a good and suitable host. Clostridium perfringens is an important pathogen of humans and livestock and produces numerous toxins including epsilon and beta which are responsible for severe diseases. In the present study a new construction containing Clostridium perfringens type D epsilon toxin gene and type B beta toxin gene was designed. At the first step two pairs of primers were used for these genes amplification. At the next step epsilon forward and beta reveres primers were used to produce a chimeric gene containing amplified partial cds of etxD and partial cds of cpbB which are linked together by the AEAAAKEAAAKA fragment as a small linker. The method was based on fusion PCR and using of Pfu DNA polymerase, which has a proofreading activity. The fusion gene inserted into pJET1.2blunt and cloned into E.coli strain TOP10. Based on the latest information, this is the first design and cloning of epsilon-beta fusion gene and also this is the first time that PCR fusion strategy is used for Clostriadial gene fusion, which could be used for development of a recombinant epsilon-beta fusion protein vaccine. This construction also could serve as a model for development and production of novel fusion protein for other potential proteins and toxins.