Detection of Paenibacillus larvae larvae spores in honey and diseased larvae Samples by culture and PCR

بيماري لوك آمريكايي يكي از جدي ترين بيماريهاي نوزادان زنبور عسل است. روش سنتي تشخيص آزمايشگاهي بيماري بر اساس كشت و شناسايي آن بر پايه آزمايش هاي بيوشيميايي، مورفولوژيكي و فيزيولوژيكي است كه اين روش همچنان قابل اطمينان بوده ولي بسيار زمانبر مي باشد.هدف اين مطالعه شناسايي اسپور هاي پني باسيلوس لاروا لاروا از كلني هاي زنبورعسل با روش واكنش زنجيره اي پليمراز بود. اين روش بسيار قابل اطمينان و سريع بوده و بيماري را مي توان در مراحل اوليه و قبل از بروز علايم كلينيكال تشخيص داد. در اين مطالعه54 نمونه از لاروهاي مشكوك به بيماري و 36 نمونه عسل كه به بخش زنبور عسل، كرم ابريشم و حيات وحش موسسه رازي ارسال شده بود مورد بررسي قرار گرفت. نمونه هاي عسل با حجم مساوي از آب مقطر رقيق شده و سانتريفوژ گرديدند و سپس رسوب براي كشت و جداسازي DNA و واكنش زنجيره اي پليمراز استفاده شد. نمونه هاي لارو در آب مقطر به صورت سوسپانسيون در آمده و خوب هموژن گرديد و پس از سانتريفوژ، رسوب براي كشت و جدا سازي DNA و واكنش زنجيره اي پليمراز مورد استفاده قرار گرفت. فرآورده واكنش زنجيره اي پليمراز روي ژل آگارز 8/0 درصد الكتروفورز گرديد. از 54 نمونه لارو، 5 مورد (3/9 در صد) و از 36 نمونه عسل، 5 مورد (9/13 درصد) از نظر وجود اسپورهاي پني باسيلوس لاروا لاروا در كشت و واكنش زنجيره اي پليمراز مثبت بودند. با بكار گيري روش واكنش زنجيره اي پليمراز و با غربالگري نمونه هاي عسل در سطح منطقه اي و ملي، مي توان عامل بيماري لوك آمريكايي را رديابي و مونيتور نموده، و روش هاي كنترلي و پيشگيرانه را قبل از وقوع بيماري و ايجاد هر نوع خسارت اعمال نمود.

American foulbrood (AFB) is the most serious brood disease of the honey bee. Traditional methods are reliable but rather slow simply because they are based on biochemical, morphological and physiological identification of cultivated isolates. The aim of this study is the detection of Paenibacillus larvae larvae spores in honey and diseased larvae samples by culture and PCR. Therefore 54 samples of diseased larvae and 36 honey samples, were diluted with an equal volume of distilled water and centrifuged, then the pellet was used for bacterial culture, DNA extraction and PCR. PCR products were electrophoresed on 0.8 % agarose gel. Five of 54 (9.3 %) larvae samples and 5 of 36 (13.9 %) honey samples were positive for Paenibacillus larvae larvae by culture and PCR. As a result, screening of honey and larvae samples by PCR method proved to be a reliable, fast and useful method on regional and national scale for monitoring, controlling, and using preventive measures before the occurrence of American foulbrood damages.