Title of article :
Cloning, expression, purification and immunoreactivity analysis of gag derived protein p17 from HIV-1 CRF35 in fusion with thioredoxin from an Iranian patient
Author/Authors :
Askari، Mohammad نويسنده Department of Medical Biotechnology, Faculty of Allied Medical Sciences, Tehran University of Medical Sciences, P.O. Box 1449614535, Tehran, I.R. Iran , , Gorjipou، Fazel نويسنده HIV Molecular Research Laboratory, Division of Virology, Department of Pathobiology, School of Public Health and Health Research Institute, Tehran Uni , , Sharifi، Zohreh نويسنده , , Farajollahi، Mohammad Morad نويسنده Department of Medical Biotechnology, Faculty of Allied Medical Sciences, Tehran University of Medical Sciences, P.O. Box 1449614535, Tehran, I.R. Iran ,
Abstract :
تاكنون، براي تشخيص و ساخت واكسن عليه ويروس HIV-1 كه عامل بيماري نقص ايمني اكتسابي مي باشد، از آنتي ژن هاي نوتركيب استفاده شده است. P17 يا ماتريكس پروتيين كه از هضم پروتيوليتيك پلي پروتيين gag به وجود مي آيد بسيار آنتي ژنيك بوده و همانند p24 حفاظت شده و ايمونوژن مي باشد. علاوه بر آن حضور آنتي باديهاي ساخته شده بر ضد p17 در سرم افراد مبتلا شايعتر از آنتي بادي موجود بر ضد p24 بوده و از آن مي توان در تعيين پيش آگهي بيماري استفاده كرد. در نتيجه، تعيين ميزان آنتي بادي هاي ضد p17 موجود درسرم فرد مبتلا، ماركر تعيين پيش آگهي بهتري نسبت به تعيين ميزان آنتي بادي هاي ضد p24 مي باشد. هدف از انجام اين طرح، كلون و بيان پروتيين p17 به شكل محلول در E.Coli و سپس ارزيابي ايميونوراكتيويتي آن مي باشد. در اين مطالعه، توالي DNA كد كننده پروتيين p17 از وكتور PTZ-gag53-IR كه حاوي تمامي توالي كد كننده پلي پروتيين gag بود، جداسازي و تكثير شد. توالي كد كننده پلي پروتيين gag با استفاده از سرم افراد مبتلا و با تكنيك nested RT-PCR بدست آمد. سيستم بياني مورد استفاده در اين طرح بر اساس پروموتر T7 مي باشد كه در كيت كلون سازي جهت دار TOPO تعبيه شده است. با استفاده از اين سيستم پروتيين p17 يا ماتريكس پروتيين به صورت فيوژن با تيوردوكسين در E.Coli بيان شد. تخليص پروتيين نوتركيب بدست آمده با استفاده از روش كروماتوگرافي جذبي به صورت موفقيت آميزي انجام شد. نتايج توالي يابي DNA نشان داد كه اين توالي متعلق به زير نوع CRF35_AD ويروس HIV-1 مي باشد كه در ايران و افغانستان شايع است. ارزيابي ايميونوراكتيويتي پروتيين نوتركيب بدست آمده با سرم افراد مبتلا به HIV، ويژگي 100% و حساسيت 8/93% را نشان داد.
Abstract :
So far, recombinant antigens of HIV-1, the etiologic cause of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), have been widely used for the diagnosis and vaccine development. P17 or the matrix protein formed by the proteolytic cleavage of gag is strongly antigenic and is as conserved and immunogenic as p24. In some cases, antibodies to p17 are more prevalent than antibodies to p24 and the decline in the level of p17 antibodies is an earlier prognostic marker for disease progression than decline in the level of antibodies to p24. The aim of this study was to clone and express the gag derived p17 protein in soluble form in E. coli and then assess the immunoreactivity of produced recombinant p17. DNA sequence encoding p17 matrix protein was cloned from PTZ-gag53-IR vector that has the complete gag polyprotein sequence. The T7-promoter-based expression system used in this study was TOPO directional cloning strategy that expressed p17 matrix protein in fusion with thioredoxin in E. Coli. Purification of produced recombinant protein has been done using Ni-NTA nickel chelating agarose beads. Sequencing result of the cloned sequence showed that it belongs to CRF35_AD subtype of HIV-1 which is highly prevalent in Iran and Afghanistan. The immunoreactivity of produced recombinant p17 to sera from infected individuals showed 93.8% sensitivity and 100% specificity.
