Author/Authors :
Karkhane، Ali Asghar نويسنده Department of Industrial and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), P.O. Box 14965/161, Teh , , Yakhchali، Bagher نويسنده , , Rastgar Jazii، Ferdous نويسنده Department of Industrial and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), P.O. Box 14965/161, Teh , , Hemmat، Jafar نويسنده Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST),P.O. Box 15815-3538 , , Shariati، Parvin نويسنده Department of Industrial and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), P.O. Box 14965/161, Teh , , Khodabandeh، Mahvash نويسنده , , Zomorodipoor، Alireza نويسنده Department of Industrial and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), P.O. Box 14965/161, Teh ,
Abstract :
تلاش براي بيان ليپاز در فضاي پري پلاسميك اشرشياكلي تا كنون ناموفق بوده است و اغلب ليپازهاي نوتركيب بيان شده در بخش نامحلول عصاره سلولي تجمع يافته اند. براي ارزيابي نقش پپتيد هاي راهنماي طبيعي و هترولوگ در انتقال ليپاز در عرض غشا داخلي E. coli، ژن ليپاز (btl2) در پايين دست پپتيد راهنماي طبيعي باسيلوس و همچنين همراه با
پپتيدهاي راهنماي pelB، ansB وansB/ASP، كلون شد. به همين منظور، چهار وكتور بياني نوتركيب (pYRKP.P، pYRKP.N، pYRKP.A و pYRKP.AA) ساخته و در در E. coli بيان شدند. بررسي شوك اسمزي نشان داد كه ليپاز نوتركيب بصورت اينكلوژن بادي در E. coli افزايش بيان داشته است. اينكلوژن بادي ليپازها بعدا حل شدند، بازارايي ساختماني شدند و با استفاده از يك مرحله ستون كروماتوگرافي تعويض يوني خالص شدند. براي بررسي موقعيت ليپاز در داخل سلول، ليپازهاي خالص شده با ايزوالكتريك فوكوسينگ لوله اي و طيف سنجي جرمي متوالي برسي شدند. نتايج تاييد كرد كه همه پپتيد هاي راهنما قادرند ليپاز را از سيتوپلاسم به درون فضاي پري پلاسميك E. coli هدايت كنند. از آنجا كه فضاي پري پلاسميك اشرشيا كلي براي تاخورده گي ليپاز مناسب نيست، ليپاز انتقال ياافته در اين فضا بصورت اينكلوژن بادي تجمع يافته است.
Abstract :
Efforts to express lipase in the periplasmic space of Escherichia coli have so far been unsuccessful and most of the expressed recombinant lipases accumulate in the insoluble cell fraction. To evaluate the role of native and heterologous signal peptides in translocation of the lipase across the inner membrane of E. coli, the lipase gene (btl2) was cloned downstream of the native Bacillus signal peptide and also in fusion with the pelB, ansB and ansB/asp signal peptides. For this purpose, four recombinant expression vectors (pYRKP.P, pYRKP.N, pYRKP. A and pYRKP.AA) were constructed and expressed in E. coli. Osmotic shock analysis showed that recombinant lipase was overexpressed as inclusion bodies in E. coli. The lipase inclusion bodies were subsequently solublized, refolded and purified using single column ion-exchange chromatography. To evaluate localization of lipase in the cell, the purified lipases were subjected to capillary isoelectric focusing and tandem mass spectrometry. Results showed that all signal peptides were able to direct the lipase from the cytoplasm into the periplasmic space of E. coli, because the periplasmic space of E. coli is not suitable for lipase folding, the translocated lipase aggregates in this space as inclusion bodies.
