Author/Authors :
ZAMANI، Akram نويسنده MSc, Department of Medical Genetics, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran , , Motallebi، Mostafa نويسنده , , Jonoubi، Parisa نويسنده Department of Biology, Kharazmi University, P.O. Box 31979-37551, Tehran, I.R. Iran , , Ghafarian-Nia، Nayere Sadat نويسنده National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, P.O. Box 14965/161, Tehran, I.R. Iran , , Zamani، Mohammad Reza نويسنده National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, P.O. Box 14965/161, Tehran, I.R. Iran ,
Abstract :
كلزا (Brassica napus L.) يكي از مهمترين گياهان زراعي روغني مي باشد. يكي از بيماريهايي كه باعث كاهش محصول كلزا مي گردد بيماري پوسيدگي ساقه مي باشد كه توسط قارچ Sclerotinia sclerotiorum ايجاد مي شود. پروتيينهاي مرتبط با بيماريزايي (PR) توانايي ايجاد مقاومت عليه پاتوژنهاي قارچي را دارد. پروتيينهاي شبه توماتيني (TLPs) نشان داده اند كه داراي فعاليت ضد قارچي عليه طيف وسيعي از پاتوژنهاي قارچي مي باشند. در اين مطالعه ژن tlp جدا شده از گياه چاودار به گياه كلزا منتقل شده است. قطعه تكثير شده (حدود 500 جفت باز) شناسايي و توسط الگوي هضم آنزيمي مورد تآييد قرار گرفته و به وكتور pUC19 منتقل گرديد. سازه بدست آمده پس از تآييد به نام pUCNG1 نامگذاري گرديد. مقايسه قطعه كلون شده با ترادفهاي DNA موجود نشان مي دهد كه اين ژن بدون اينترون مي باشد. ژن tlp پروتييني با 173 اسيد آمينه و وزن ملكولي 7/17 كيلودالتون را كد مي نمايد. ترادف اسيد آمينه اي TLP مورد مطالعه، مشابهت معني داري را با TLP چاودار و ديگر گياهان از خود نشان مي دهد. براي بررسي فعاليت ضد قارچي اين پروتيين، از بيان اين پروتيين در گياه تراريخت كلزا استفاده گرديد. بدين منظور سازه حاوي ژن tlp كه تحت كنترل پروموترCaMV35S قرار داشت به Agrobacterium tumefaciens منتقل و با استفاده از الگوي PCR تآييد و به ريزنمونه هاي كوتيلدوني گياه كلزا واريته R-line Hyola308 منقل گرديد. گياهان تراريخت بدست آمده با استفاده از الگوي PCR و dot blot موري تآييد قرار گرفتند. جهت بررسي مقاومت اين گياهان به قارچ S. sclerotiorum از آزمون detached leaf assay استفاده گرديد. اندازه لكه هاي ايجاد شده توسط قارچ مورد استفاده در برگ گياهان تراريخت به طور معني داري نسبت به لكه هاي ايجاد شده در گياهان غيرتراريخت كاهش يافته است.
Abstract :
Canola (Brassica napus L.) is an important oilseed crop. A serious problem in cultivation of this crop and yield loss, are due to fungal disease stem rot caused by Sclerotinia sclerotiorum. The pathogenesis-related (PR) proteins have the potential for enhancing resistance against fungal pathogen. Thaumatin-like proteins (TLPs) have been shown to have antifungal activity on various fungal pathogens. In this study, the tlp gene isolated from cereal rye (Secale cereal L.) was introduced into canola plants. The amplified DNA fragment (about 500 bp) was analyzed and confirmed by restriction pattern and cloned into pUC19 and designated as pUCNG1. Comparison of the cloned fragment with the DNA sequence indicated that this gene contains no intron. The tlp gene was predicted to encode a protein of 173 amino acids with an estimated molecular mass of 17.7 kDa. The deduced amino acid sequence of TLP showed a significant sequence identity with TLP from S.cereal and other plants. We used a transgenic over-expression approach in order to investigate antifungal activity of expressed TLP on Sclerotinia sclerotiorum. TLP was overexpressed under the CaMV35S constitutive promoter in (Brassica napus, R line Hyola 308). Transformation of cotyledonary petioles was achieved via Agrobacterium tumefaciens LBA4404. The insertion of transgene was verified by the polymerase chain reaction (PCR) and genomic DNA dot blotting. Antifungal activity was detected in transgenic canola lines using detached leaf assay. The size of lesions induced by S. sclerotiorum in the leaves of transgenic canola was significantly retarded when compared to that detected in non-transgenic plants.
