Improved shoot regeneration protocol for canola explants and pre-assessment of salinity tolerance in canola transgenic plants

باززايي ريزنمونه ها نقش مهمي در تراريخت نمودن گياه دارد. نوع ريزنمونه، غلظت هورموني، و دوره قبل از كشت در كارايي تراريخت نمودن حايز اهميت هستند. به منظور دستيابي به يك تراريزش كارآمد در كلزا و بهينه سازي شرايط باززايي گياه، ريزنمونه هاي مختلف همراه با محيط كشت هاي مختلف مورد مطالعه قرار گرفتند. چهار رقم كلزا براي ارزيابي قابليت باززايي از ريزنمونه هاي هيپوكوتيل برگ و برگ لپه اي مورد استفاده قرار گرفت. علاوه بر اين، ريزنمونه هاي برگ لپه اي در محيط كشت MS حاوي پنج غلظت مختلف BAP مورد ارزيابي قرار گرفتند. مناسب بودن ريزنمونه هاي برگ لپه اي در آزمايش تراريختگي توسط يك ژن خارجي كد كننده P5CS، آنزيم كليدي در بيوسنتز پرولين، اندازه گيري شد. تراريزش ريزنمونه هاي برگ لپه اي از طريق انتقال ژن با واسطه Agrobacterium tumefacience و با روش افزايش گام به گام نشانگر گزينشي صورت گرفت. PCR و تجزيه محتواي پرولين موفقيت تراريزش را تاييد نمود. ريزنمونه هاي برگ لپه اي كارايي بالاتري در باززايي در مقايسه با ريزنمونه هاي هيپوكوتيل نشان دادند. علاوه بر اين ، BAP با غلظت 5 ميلي گرم در ليتر در محيط كشت MS نرخ تراريختگي را افزايش داد. نتايج نشان داد كه پيش كشت ريزنمونه ها به مدت 48 ساعت نرخ تراريزش را افزايش مي دهد. ارزيابي غلظت پرولين نيز بيان و فعاليت ژن منتقل شده را تاييد نمود. گياهان تراريخت داراي ژن P5CS در مقايسه با گياهان غير تراريخت كنترل، به شوري مقاوم تر بودند.

Regeneration of explants plays a significant role in plant transformation. Explant type, hormonal concentration, and pre-culturing period are important in transformation efficiency. To get an efficient transformation of canola and optimize regeneration conditions, different explants along with different culture media were studied. Four canola varieties were used to evaluate regeneration ability of hypocotyledonary and cotyledonary leaf explants. In addition, cotyledonary leaf explants were evaluated on the MS medium containing five different concentrations of BAP. Suitability of cotyledonary explants in transformation experiment was assayed by an exogenous gene, coding for P5CS, the key enzyme in proline biosynthesis. The transformation of cotyledonary explants through Agrobacterium tumefacience-mediated gene transformation was used in a stepwise increased selection marker manner. PCR and proline content analysis confirmed the success of transformation. Cotyledonary explants displayed a higher regeneration efficiency than hypocotyledonary explants. In addition, BAP at 5 mg/l in the MS medium increased the rate of regeneration. Results showed that pre-culturing explants for 48 h increased the rate of transformation. Assessing the proline concentration further verified the expression and activity of the transformed gene. The P5CS transformed plants were more resistant to salinity compared to the non-transgenic control plants.