عنوان :
مطالعه بيماري نكروز عصبي ويروسي (جداسازي، شناسايي، و بيماريزائي آن) در كفال ماهيان درياي خزر و احتمال انتقال آن به ساير ماهيان
شرح پديد آور/مجري (مجريان) طرح :
ذريه ز هرا، جليل
شناسه هاي افزوده :
شريف پور، عيسي ، همكارطرح , قرشي، علي ، همكارطرح , صابرفر، اسماعيل ، همكارطرح , شريف روحاني، مصطفي ، همكارطرح , صيفوري، پروانه ، همكارطرح , بهروزي، شهريار ، همكارطرح , لالويي، فرامرز ، همكارطرح , شناورماسوله، عليرضا ، همكارطرح , معصوم زاده، جليل ، همكارطرح , مهديزاده، محمد ، همكارطرح , ميرهاشمي نسب، محمدرضا ، همكارطرح , اصغرنيا، كامران ، همكارطرح , صالحي تبار، ريحانه ، همكارطرح , كاكولكي، شاپور ، همكارطرح , بازاري مقدم، سهيل ، همكارطرح , علي، حلاجيان ، همكارطرح , عليزاده، مهدي ، همكارطرح , جليل پور، جليل ، همكارطرح , چكمه دوز، فريدون ، همكارطرح , نظام آبادي ، حسن ، همكارطرح , فقيد، منيره ، همكارطرح , سعيدي، علي اصغر ، همكارطرح , بينايي، محمد ، همكارطرح , نيراني، محبوبه ، همكارطرح , زاهدي، آذين ، همكارطرح , مخبر ملكي، بهراز ، همكارطرح , نظري ، عليرضا ، همكارطرح , مخبر ملكي، بهراز ، همكارطرح , رمضاني، بابك ، همكارطرح , نهرور، رضا ، همكارطرح , دقيق روحي ، جواد ، همكارطرح , نوري، عباس ، همكارطرح , درويشي ، غلامرضا ، همكارطرح , بري، عباس ، همكارطرح , فرح تاج، فيروزه ، همكارطرح , سلطاني، مهدي ، همكارطرح
تنالگان :
وزارت ﺟﻬﺎد ﮐﺸﺎورزي - ﺳﺎزﻣﺎن ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت، آﻣﻮزش و ﺗﺮوﯾﺞﮐﺸﺎورزي - ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر
چكيده فارسي :
اين مطالعه به منظور جداسازي و شناسايي نوداويروس عامل بيماري نكروز عصبي ويروسي( VNN ) از ماهيان كفال طلايي(liza auratus) درياي خزر صيد شده در صيدگاههاي استانهاي حاشيه جنوب درياي خزر شامل گيلان، مازندران و گلستان و با كمك روشهاي كشت سلولي، واكنش زنجيره اي پليمراز دو مرحله اي (Nested-RT-PCR) ، آزمايش پادتن هاي درخشان) (IFAT ، ايمونوهيستوشيمي (IHC) ، هيستوپاتولوژي، هماتولوژي، باكتريولوژي و ميكروسكوپ الكتروني انجام شد.
پس از دريافت گزارشهاي متعدد مبني بر بروز تلفات و مشاهده علايم باليني شامل شناي نامتعارف ( مارپيچي، چرخشي، خوابيده به پشت در سطح آب ) و اتساع محوطه شكمي در ماهيان كفال طلايي صيد شده در صيدگاههاي سه استان مذكور ضمن مراجعات مكرر به پره هاي صيادي در طول فصول صيد سالهاي 1385 تا 1388 تعداد 428 ماهي كفال طلايي در محدوده وزني 50 تا 250 گرم نمونه برداري گرديدندكه تعدادي در حدود 312 ماهي كفال در استان گيلان و 116 عدد نيز از استانهاي گلستان و مازندران صيد شدند كه اغلب آنها داراي علائم باليني همچون شناي نامتعادل، تيرگي رنگ بدن و اتساع محوطه شكمي بودند.
بافتهاي مغز و چشم از ماهيان مورد مطالعه در شرايط استريل جداسازي و جهت انجام آزمايشات كشت سلولي و Nested-RT-PCR در فريزر C°80 – نگهداري شدند. به طور همزمان قطعاتي از بافتهاي مذكور در فرمالين 10 درصد جهت انجام آزمايشات هيستوپاتولوژي و ايمونوهيستوشيمي و قطعه اي در گلوتارآلدهيد 3 درصد براي آزمايش ميكروسكوپ الكتروني تثبيت گرديدند.شش روز بعد از تلقيح هموژن فيلتر شده بافتهاي مغز و چشم بر روي تك لايه سلولي SSN-1 ، آثار آسيب سلولي ( CPE ) به صورت واكوئولاسيون مشاهده شد كه در پاساژهاي دوم و سوم نيز با شدت بيشتري ايجاد گرديد. در مجموع تلقيح هموژن 9 نمونه از 312 ماهي باعث ايجاد CPE گرديد.
انجام آزمايش Nested- RT-PCR بر روي نمونه هاي بافتي و سلول هاي SSN-1 آلوده شده( CPE مثبت) نتايج مشابهي را به همراه داشت. در آزمايش مستقيم نمونه هاي بافتي تعداد 21 نمونه مثبت بود وهمچنين تمام نمونه هاي حاصل از سلولهاي SSN-1 آلوده( CPE مثبت) در آزمايش مزبور مثبت تشخيص داده شدند.
در ادامه تشخيص نوع ويروس، آزمايش پادتن هاي درخشان با استفاده از دو نوع آنتي بادي مونوكلونال مختلف برروي مقاطع بافتي مغز و چشم ماهيان كفال داراي علايم و سلول هاي آلوده شده SSN-1 انجام شدكه ايجاد نقاط درخشان حاكي از وجود آنتي ژن نودا ويروس در نمونه هاي مورد آزمايش بود و نتايج كشت سلول و Nested- RT- PCR را تاييد نمود.
در آزمايشات آسيب شناسي بافتي، واكوئولاسيون در مقاطع مغز و شبكيه چشم، نخاع و عصب بينايي در اكثر نمونه ها مشاهده گرديد و با استفاده از آنتي بادي مونوكلونال ضد نودا ويروس و رنگ آميزي DAB بر روي مقاطع بافتي در آزمايش ايمونوهيستوشيمي، حضور آنتي ژن هاي نودا ويروس به صورت نقاط قرمز- قهوه اي مشخص گرديد.
در آزمايش ميكروسكوپ الكتروني با توجه به پراكندگي ويروس در نمونه هاي بافتي، مقاطع ويروس به صورت دوايري با قطر حدود nm 30 و داراي آرايش منظم تنها در يك نمونه از مقطع چشم ماهي كفال طلائي مشاهده گرديد.
به منظور تعيين بيماريزايي ويروس جداشده و بررسي امكان انتقال آن از ماهي كفال طلائي به گونه هاي ديگر، سوپرناتانت سلول SSN-1 داراي CPE با ماهيان گوپي ( به صورت حمام) و بچه ماهيان قره برون ( به صورت تزريق در پشت حدقه چشم) مواجهه داده شد كه در هر دو مورد علاوه بر بروز علايم باليني، واكوئولاسيون شديد در مغز و شبكيه چشم آنها نيزمشاهده شد.
در ادامه مطالعات بيماريزائي، نمونه هاي ماهي گوپي داراي علائم باليني با ميكروسكوپ الكتروني و آزمايش ايمونوهيستوشيمي مورد بررسي قرار گرفتند و نتايج حاصله نشان داد كه حضور نودا ويروس با بروز علايم باليني، كالبد گشايي و تلفات در ارتباط بوده و مي توان بتا نودا ويروس را به عنوان عامل اصلي تلفات ناشي از بروز بيماري نوپديد نكروز عصبي ويروسي (VNN) دركفال ماهيان درياي خزر محسوب نمود.
چكيده انگليسي :
Viral Nervous Necrosis (VNN) is a worldwide disease affecting several species of cultured marine fish. For the past two decades, betanodavirus infections that cause Viral Nervous Necrosis (VNN) have emerged as major constraints on the culture and sea ranching of marine fish in almost all parts of the world. More than forty species mainly of marine origin have been so far affected and this number is likely to rise in future following the introduction of new species and the increase of aquaculture trade.
Unknown acute mortality occurred in wild golden grey mullet Lisa auratus and Liza saliens in Iranian waters of Caspian Sea in recent years. In order to isolation and confirmation of causative agents of golden grey mullet mortality in the Caspian Sea, a complementary research investigation project was designed in 2005 and approved immediately in Iranian Fisheries Research Organization (IFRO). Many diagnostic aspects such as Virology (Cell culture and Elctereone Microscopy), Hemathology, Bacteriology, Histopathology, Molecular biology (Nested-RT-PCR), Heavy metals measuerment and Serology (IFAT and IHC) were employed in mentioned multidiciplinary project. About 322 moribund fish samples which revealed skin darkening, erratic swimming behavior such as spiral and belly-up at rest and high distention of swimming bladder. Suspected samples were collected from coastal capture sites in iranian north proviences in 2006 till 2009. Targets tissue such as brain and eye were removed in strile condition and then kept in -80oC frezzer for cell culture and Nested-RT-PCR. Other tissue samples from liver, kidney, intestine, stomach, gill, skin and muscle, gall bladder and gonads were taken and fixed in 10% buffer formalin and same parts fixed in glutaraldehyde 3% for histopathology, IHC and EM respectively. Cytopathic effect (CPE) was observed in those cell cultures just six days after inoculation with the dilutions of the tested 312 homogenate supernatants. CPE in monolayers of cells cultured (SSN-1 cell line) was characterised by thin or rounded, refractile, granular cells with vacuoles. Nine samples were positive in virology assay. Nested- RT-PCR was done on suspected tissue samples and supernatant of CPE positive samples and 21 tissue samples and all CPE positive samples were positive. IFAT was selected as a confirmatory method for identifying viral strains replicating on cell cultures and carried out with rabbit anti-betanodavirus serum on suspected tissue samples and some smears of CPE positive samples. Some bright points approved betanodavirus antigen and confirmed cell culture and Nested-RT-PCR findings.
In fixed tissue samples widespread and massive vacuolation were observed in brain, spinal cord, retina and optical nerve. In order to confirmation of diagnostic findings , IHC was done with monoclonal antibody anti-betanodavirus and some red-brown points were observed. Theses findings revealed expected viral antigens and confirmed previous results. Moreover, virus particles with 25-30 nm in diameter were visualized in infected brain and retina using positive staining in TEM. Also pathogenicity test was employed to confirm the obtained results. So Guppy fish Poecilia reticulata and sturgeon fry were used instead of the experimental host due to ease of handling and susceptibility. After 15 days post infection, guppy bathed in VNN-infected tissue culture with 104 TCID50 showed clinical signs similar to naturally infected Golden grey mullet, and the mortality rate reached up to 100% in 75 dpi. When target organs were examined by cell culture isolation, serology, and histopathology, all revealed the presence of virus in the Guppy. Suspected supernatant injected to sturgeon fry through intravitreous injection and widespread vacuolation were observed in brain and spinal cord buy IHC and Real time PCR were negative. In conclusion, with attntion to obtained results in this investigation such as ecological factors, clinical signs, histopathological, virological and bacteriological results, molecular analysis, (IHC, IFAT, PCR), TEM demonstration, serological and hematological findings, it could be confirmed that VNNV was the main causative agent for disease outbreak in Golden grey mullet in Southern coastline of Caspian Sea.
كليدواژه :
Nested-RT-PCR , آزمايش پادتن هاي درخشان , ايمونوهيستوشيمي , ايران , درياي خزر , بيماري نكروز عصبي ويروسي , كفال طلايي
اطلاعات نشر :
تهران موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور
مشخصات ظاهري :
بخشي رنگي، جدول، رنگي، مصور، نمودار
فروست :
موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور 43010
كتابنامه :
كتابنامه: ص. 126- 134
موضوع :
ماهي ها- بيماري هاي ويروسي , كفال ماهي- بيماري هاي ويروسي , كفال ماهي- درياي خزر- بيماري هاي ويروسي
