1309

توليد واكسن (زنده) نوتركيب عليه بيماري استرپتوكوكوزيس براي ايمن كردن قزل آلاي رنگين كمان (Onchorhynchus mykiss) (فاز 1)

پورغلام ، رضا

شريف روحاني، مصطفي ، همكار طرح , ساسان، حسينعلي ، همكار طرح , لالويي، فرامرز ، همكار طرح , صفري، رضا ، همكار طرح , سعيدي، علي اصغر ، همكار طرح , سلطاني، مهدي ، همكار طرح

1395

سازمان تحقيقات، آموزش و ترويج كشاورزي - موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

هدف اصلي اين تحقيق بررسي امكان توليد واكسن زنده نوتركيب عليه استرپتوكوكوزيس در قزل‌آلاي رنگين كمان و ايمن كردن ماهيان قزل آلا عليه اين بيماري بوده است. بدين منظور ابتدا حدود 520 نمونه ماهي بيمار از72 مزرعه پرورش ماهي از 8 استان كشور جمع‌آوري شد. نمونه‌ها پس از كشت در محيط‌هاي اختصاصي و آزمايش‌هاي بيوشيميايي و تعيين بعضي از گونه‌هاي استرپتوكوكوس، با استفاده از روشهاي مولكولي تائيد تشخيص شدند. پس از انجام اين آزمايشات، مشخص شد كه حدود 40% ماهيان (حدود 206 نمونه) به گونه‌هاي مختلف استرپتوكوكوس آلوده بودند. در مجموع تعداد 172 نمونه DNA از گونه هاي مختلف استرپتوكوكوس استخراج گرديد و با توجه به نتايج بدست آمده، گونه هاي S.uberis، S.agalactiae ، S.dysgalacotia ، S.faecium و iniae S. شناسايي شدند. با توجه به اينكه آنزيم فسفوگلوكوموتاز به عنوان مهمترين عامل در توليد كپسول پلي ساكاريدي و بيماريزايي گونه استرپتوكوكوس اينيايي شناسايي شده است پس از جداسازي استرپتوكوكوس اينيايي، كلونينگ ژن pGM انجام گردبد. پس از تكثير موفقيت آميز اين ژن در وكتور pTZ57R/T كلون گرديد. پلاسميد نوتركيب( (PNZ8048 پس از هضم آنزيمي در وكتور بياني pEtDuet-1 ساب كلون و به روش PCR تائيد گرديد. ضمنا به منظور تكثير ژن هاي simA و cpsD از پرايمرهاي يونيورسال pNZ8148 و اختصاصي ژن هاي simA و cpsD استفاده گرديد. براي انجام واكنش انتقال پلاسميد به باكتري Lactococcus lactis از باكتري مهندسي شده Lactococcus lactis (NZ9000) استفاده گرديد. واكسيناسيون به سه روش خوراكي، غوطه وري و تزريقي (داخل صفاقي) انجام شد كه در هر سه روش و همه تيمارها ميزان كارايي واكسن منتج از ژن (g2) در مقايسه با ژن (g1) بهتر بود. براي انداره گيري ميزان IgM يا به عبارت دقيق تر رديابي آنتي باديهاي ضد استرپتوكوكوس اينيايي از روش ELISA استفاده شد. نتايج نشان داد در هر سه روش و در همه تيمارها (همه دوزها و هر دو ژن g1 و (g2ميزان IgM در مقايسه با شاهد داراي اختلاف معني دار (05/0p<) بوده است. نتايج رويارويي ماهيان واكسينه شده با باكتري استرپتوكوكوس اينيايي نشان داد كه در صد بقاء نسبي ماهيان در همه تيمارها بجز تيمار3 (63/42 درصد) بالاي 50 درصد و براي گروه كنترل نيز 43/21 درصد بوده است. بيشترين درصد بقاء نسبي ماهيان مربوط به تيمار 11 (25/61 درصد) بود و آناليز آماري حاكي از اختلاف معني دار بين درصد بقاء نسبي ماهيان واكسينه شده با گروه كنترل مي باشد (05/0p<).

Abstract The main purpose of this study was survey on achieving recombinant DNA vaccine (live delivery) against streptococcusis for Rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) Immunization. Initially, a total of 515 samples were collected from the head kidney of diseased fish (weigh 50_200g) in 72 farms of 8 provinces. Approximately, 40% (206 samples) of specimens were infected to Streptococcus species. Then were isolated 172 DNA samples and consequently, five pathogenic species have been identified, including S. iniae, S. faecium, S. agalactiae, S. dysgalatiae, and S. uberis. The enzyme phosphoglucomutase (PGM) has recently been discovered to play an important role in polysaccharide capsule production and virulence in S. iniae. Therefore, was initially isolated S. iniae and cloning phosphoglucomutase gene. Then, the PGM gene was amplified successfully and cloned in pTZ57R cloning vector. The recombinant plasmid was sub cloned into pETD uet-l expression vector by restriction enzymes and confirmed by PCR. Meanwhile, for amplifying simA and cpsD genes were used universal primers pNZ8148 and special for simA and cpsD genes.The recombinant bacteria Lactococcus lactis (NZ9000) was used for transformation the plasmid into Lactococcus lactis. Vaccination was performed by oral, bath and injection (peritoneal) methods. The efficiency of g2 was better than g1in these three methods and all of groups. The determination of IgM level, or detection of anti S. iniae antibody was carried out by using ELISA. The results revealed that there was a significant (p<0.05) difference between the level of IgM in all three methods and experiment groups compare to control group. The results of challenge of vaccinated fish with S. iniae showed that fish RPS in all of groups except group 3 (42.63 percent) were more than 50 percent while, in control group was 21.43 percent. The highest fish RPS was belong to group 11(61.25 percent) and statistical analyses revealed that significant (p<0.05) difference between fish vaccinated RPS, compare to control group.

واكسن نوتركيب , قزل‌آلاي رنگين , استرپتوكوكوزيس , فسفوگلوكوموتاز

تهران موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

جدول، رنگي، مصور، نمودار

موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور 50553

كتابنامه: ص. 69- 73

ماهي ‌ها- مايه ‌كوبي , ماهي ‌ها- ايمني ‌شناسي , قزل آلاي رنگين كمان- ايمني شناسي , ماهي ها- بيماري ها

3

ت716پ

639