1601

مطالعه كنترل زيستي شكوفايي جلبكي مضر با استفاده از باكتريهاي دريايي بومي خليج فارس در شرايط آزمايشگاهي

گذري، محسن

كريم زاده، رامين همكارطرح , عبدالعليان، عيسي همكارطرح , محبي نوذر، ليلي همكارطرح , زاهدي، احمد همكارطرح , معزي علي، مريم همكارطرح , آرميده، علي همكارطرح , فروغي فرد، حجت الله همكارطرح , صدريان، منصور همكارطرح , بهزادي، سيامك همكارطرح , ابراهيمي، محمود همكارطرح , ملكوتي، محسن همكارطرح , حامدي، جواد همكارطرح , جاسبي، امير رضا همكارطرح , رضواني گيل كلايي، سهراب همكارطرح , اسلامي، حبيب الله همكارطرح , اسلامي، فرشته همكارطرح , اسماعيلي، فريبا همكارطرح , صادقي، محمدرضا همكارطرح

1397

ﺳﺎزﻣﺎن ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت، آﻣﻮزش و ﺗﺮوﯾﺞﮐﺸﺎورزي - ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر - ﭘﮋوﻫﺸﮑﺪه اﮐﻮﻟﻮژي ﺧﻠﯿﺞ ﻓﺎرس و درﯾﺎي ﻋﻤﺎن

پديده اي فزاينده، جهاني و داراي اثراتي شديد بر سلامت انسان، ساختار و عملكرد اكوسيستم و صنايع مختلف مي باشد. كنترل زيستي اين پديده با استفاده از باكتريهاي دريايي به عنوان يكي از روشهاي مطرح در استراتژي مديريت تلفيقي اين پديده مورد توجه مي باشد. پروژه حاضر با هدف دستيابي به باكتريهاي بومي عامل كنترل زيستي شكوفايي جلبكي مضر در خليج فارس در مقياس آزمايشگاهي برنامه ريزي و اجرا گرديد. در اين مطالعه نمونه برداري از رسوبات و آب دريا بصورت فصلي از ده ايستگاه واقع در مناطق ساحلي استان هرمزگان، چهار گونه اسفنج هاي دريايي و 3 گونه مرجان به عنوان منبع جداسازي باكتريهاي عامل كنترل زيستي مورد مطالعه قرار گرفتند. بررسي الگوي فراواني فصلي باكتريها در نمونه هاي آب و رسوب بيانگر كمينه فراواني باكتريها در فصل زمستان و بيشينه آن در فصل بهار و تابستان بود. الگوي تنوع باكتريهاي جداشده نشان داد تنوع زيستي بالاتري در نمونه هاي رسوب نسبت به نمونه هاي آب وجود دارد. فلور غالب باكتريها در رسوبات و آب شاملVibrionacea، Enterobacteriaceae ، Pseudomonadaceae و Bacillaceae بود درحاليكه در نمونه هاي اسفنج و مرجان بترتيب خانواده هاي Streptomycetaceae و Alteromonadaceae حضور غالبي نشان دادند. الگوي فعاليت جلبك كشي باكتريهاي جداشده از منابع مختلف در مقابل گونه Cochlodinium polykrikoides به عنوان شاخص غربالگري بيانگر بيشترين نسبت جدايه هاي داراي فعاليت ضد جلبكي بالا (%90< ) در نمونه هاي اسفنج و مرجان بترتيب معادل 40% و 28% بود. سنجش فعاليت جلبك كشي متابوليت هاي ثانويه 30 جدايه منتخب بيانگر فعاليت جلبك كشي 26 جدايه با LC50 كمتر از mg/ml1 در مقابل C. polykrikoides بود. به منظور دستيابي به باكتريهاي با طيف اثر انتخابي از استراتژي غربالگري مرحله اي در مقابل طيفي از ارگانيسم هاي مختلف استفاده گرديد. از اينرو سنجش فعاليت ضد جلبكي جدايه هاي برتر در مقابل گونه هاي جلبكي مفيد galbana Isochrysis و Chlorella vulgaris 9 جدايه فاقد سميت گزارش شد. متابوليت هاي استخراج شده از بترتيب 90، 55 و 35 درصد جدايه ها در مقابل Candida albicans ، Aspergillus niger و Penicillium chrysogenum فعاليت ضد قارچي در محدوده µg/ml 64 تا 1024 نشان دادند. همچنين بترتيب 65، 40 ،80 و 25 درصد جدايه ها در مقابل باكتريهاي Staphylococcus aureus،coli Escherichia و Micrococcus luteus و Pseudomonas aeroginosa فعاليت ضد باكتريايي متغير از µg/ml 32 تا 1024 ارايه نمودند. بررسي سميت متابوليت هاي ثانويه جدايه هاي منتخب در مقابل Artemia salina نشان داد 30 درصد تا غلظت µg/ml 1000 فاقد سميت بودند. همچنين در آزمون سنجش ميزان كشندگي لارو ميگو 6 جدايه اثر سميتي نشان ندادند. بررسي اثر سيتوتوكسيك متابوليت هاي ثانويه جدايه هاي برتر منتخب در مقابل رده سلولي انساني HUVEC نشان داد 5 جدايه بدون اثر سيتوتوكسيك و يك جدايه سميت پاييني بروز داد. در نهايت ادامه مطالعه روي اين 6 جدايه برتر انجام شد. كينتيك رشد جدايه هاي برتر ارتباط تعداد باكتريها و فعاليت جلبكي كشي را در كشت توام نشان داد. همچنين مكانيسم فعاليت جلبكي كشي جدايه هاي برتر متاثر از متابوليسم ثانويه و ترشح عوامل زيست فعال تعيين گرديد. نتايج شناسايي پلي فازي نشان داد جدايه هاي S 202،SP 149،SC 77 ، SP 158 و SC 41 بترتيب سويه هاي جديدي از Streptomyces rochei ،Streptomyces olivaceus، Streptomyces cavourensis، Pseudomonas azotoformans، Vibrio alginolyticus بوده و جدايه W12 متعلق به Vibrio rotiferianus بود. مطالعات فيلوژنتيك سير تكاملي، فاصله ژنتيكي و ميزان واگرايي سويه هاي مورد بررسي را ارايه نمود. پروفايل و ماهيت شيميايي متابوليت هاي ثانويه استخراج شده از 6 سويه منتخب طي غربالگري شيميايي بيانگر حضور گروه هاي عاملي ترپنوييدي، فلاوونوييدي،پپتيدي، ايندول آلكالوييدي و فنولي در عصاره متابوليت هاي ثانويه مورد بررسي بود. ماهيت شيميايي فراكسيون جلبك كش سويه هاي S 202،SP 149،SC 77 ، SC 41 ترپنوييدي يا فلاونوييدي ، سويه SP 158 فنولي و سويه W 12 پپتيدي شناسايي شد. پس از خالص سازي تركيبات جلبك كش توليد شده با استفاده از روش هاي كروماتوگرافي لايه نازك،تهيه اي، ستوني و مايع با كارايي بالا زمان بازداري سويه هاي SC 41 و SP 149 58/10 و 00/11 دقيقه ثبت گرديد. اجراي پروژه حاضر منجر به اكتشاف 6 سويه باكتري بومي خليج فارس با فعاليت انتخابي در مقابلC. polykrikoides عامل اصلي شكوفايي اخير جلبكي در خليج فارس و درياي عمان گرديد. اين سويه هاي بومي از پيش نيازهاي عوامل كنترل زيستي در شرايط آزمايشگاهي برخوردار بوده و مي توانند به صورت بالقوه در محيط هاي دريايي يا مزارع و قفس هاي پرورش آبزي در مطالعات ميداني مطرح گردند. همچنين اين پروژه درك جديدي از الگوي پراكنش فصلي و تنوع زيستي باكتريهاي قابل كشت در آب و رسوبات دريايي منطقه مورد مطالعه و همچنين الگوي فراواني و تنوع زيستي باكتريهاي قابل كشت در چهار گونه اسفنج و سه گونه مرجان بومي خليج فارس را ايجاد نمود

bstract Harmful algal blooms are global and expanding phenomena that cause adverse effects on human health, structure and function of ecosystems, fishery industries and aesthetics of the coastal regions. One of the major methods that was considered in integrated management strategy to control HABs is biological control using indigenous bacteria. The main aim of the present study was to achieve indigenous bacteria that could control HABs in Persian Gulf in lab scale. The water and sediment samples were collected seasonally from 10 stations throughout the Hormozgan province. In addition, four sponge species and three coral species were collected as isolation source of bacteria. The seasonal frequency pattern of bacteria in water and sediment samples showed that the minimum frequency was recorded in winter and the maximum was observed in the spring and summer. The diversity pattern of isolated bacteria revealed the higher bacterial diversity in sediment samples rather to water samples. The Vibrionacea, Bacillaceae, Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae families were dominated in sediments and water samples. While in sponge and coral samples the Streptomycetaceae and Alteromonadaceae families were prevalent. The algicidal pattern of isolated bacteria against Cochlodinium polykrikoides as a screening index revealed that sponges and corals included the highest proportion of potent algicidal bacteria (>90%) with 40% and 28% respectively. Among 30 selected isolates, extracted secondary metabolites from 26 isolates exhibited LC50 less than 1 mg/ml against C. polykrikoides. Stepwise screening strategy was used to obtain bacteria with selective spectrum activity. Hence, biological activity of potent isolates were determined against related organisms. In this regard, the result of algicidal assay showed that 9 isolates could not inhibit the growth of galbana Isochrysis and Chlorella vulgaris as useful algal strains. The extracted metabolites from 90%, 55%, and 35 % of potent isolates exhibited antifungal activity against Candida albicans, Aspergillus niger and Penicillium chrysogenum at range of 64 to 1024 µg/ml. Moreover 65, 40, 80 and 25% of isolates showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus Escherichia coli, Micrococcus luteus and Pseudomonas aeroginosa varied from 32 to 1024 µg/ml. Toxicity assay against Artemia salina revealed 30 % of isolates were not toxic up to 1000 µg/ml. in addition, 6 isolates showed any toxicity against shrimp larva in vitro. Determination of toxicity against human umbilical vein endothelial cells revealed that five isolates were not toxic and one isolate exhibited low toxicity. Finally, these six isolates selected for further studies. The growth kinetics of these six isolates revealed the relationship between the number of bacteria and their algicidal activity in co-culture condition. Moreover, the production of secondary metabolites determined as the main algicidal mechanism. The results of polyphasic identification showed that S 202, SP 149, SC 77, SP 158 and SC 41 isolates were new strains of Streptomyces rochei،Streptomyces olivaceus ، Streptomyces cavourensis، Pseudomonas azotoformans، Vibrio alginolyticus and W12 was belonged to Vibrio rotiferianus. The evolutionary route, genetic distance and divergency rate of the strains were determined. Chemical screening revealed the chemical profile and identity of extracted secondary metabolites from the six strains. Their chemical profile showed the presence of some functional groups, including terpenoids, flavonoids, peptides, indole alkaloids and phenols in crude extracts. The chemical identity of algicidal fractions of S 202, SP 149, SC 77, SC 41 strains were determined as terpenoid or flavonoid. While, the active fraction of SP 158 and W 12 belonged to phenols and peptide groups respectively. After the purification using chromatographic methods, high performance liquid chromatography recorded the retention time 10.58 and 11 for the active fractions of SC 41 and SP 149 respectively. This project led to the discovery of six strains of indigenous bacteria with selective algicidal activity against C. polykrikoides as the main cause of HABs in Persian Gulf and Oman Sea. These indigenous strains have essential prerequisites for biological control agent in situ condition and can consider as potential candidates in marine environments and aquaculture farms and cages in field studies. In addition, this study provided new understanding of seasonal distribution pattern and biodiversity of culturable bacteria in marine sediments and waters as well as bacterial diversity of collected indigenous sponge and coral samples from the Persian Gulf.

كنترل زيستي , تركيبات جلبك كش , خليج فارس , خليج فارس , Cochlodinium polykrikoides , باكتريهاي دريايي , شكوفايي جلبكي مضر

تهران ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر

مصور، جدول، نمودار

ﺳﺎزﻣﺎن ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت، آﻣﻮزش و ﺗﺮوﯾﺞﮐﺸﺎورزي - ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر - ﭘﮋوﻫﺸﮑﺪه اﮐﻮﻟﻮژي ﺧﻠﯿﺞ ﻓﺎرس و درﯾﺎي ﻋﻤﺎن 53963