403

بررسي امكان شناسايي كلونينگ و بيان ژن هورمون رشد فيل ماهي (Huso huso) در ميزبانهاي پروكاريوتي و يوكاريوتي

عزيززاده پرمهر، ليلا

پوركاظمي، محمد ، همكارطرح , يارمحمدي، مهتاب ، همكارطرح , عصفوري، رحيم ، همكارطرح , صنعتي، محمد حسين ، همكارطرح , رضواني، سهراب ، همكارطرح

1395

سازمان تحقيقات، آموزش و ترويج كشاورزي - موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

در اين مطالعه، بررسي امكان شناسايي، كلونينگ و بيان ژن رشد فيل ماهي در باكتري و مخمر مورد مطالعه قرار گرفت. در مرحله اول براي شناسايي ژن نمونه برداري از غده هيپوفيز 3 عدد فيل ماهي بالغ انجام شد. سپس ‭RNA ‬استخراج شد و سنتز ‭cDNA ‬براساس ژنهاي ثبت شده در ‭NCBI ‬انجام گرفت. نمونه ‭cDNA ‬اختصاصي تكثير شده در وكتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬كلون گرديد و توالي يابي شد. توالي نوكلئوتيدها نشان داد كه ژن رشد فيل ماهي داراي قالب باز خواندن ‮‭645‬ جفت باز مي باشد كه ‮‭214‬ باقيمانده اسيد آمينه اي را كد مي كند. جايگاه برش سيگنال پپتيد در موقعيت ‮‭72‬ ژن پيش بيني شد كه سيگنال پپتيد ‮‭24‬ اسيدآمينه اي ايجاد مي كند و ژن بالغ داراي ‮‭190‬ اسيدآمينه مي باشد. بررسي هاي فيلوژنيك براساس توالي اسيدآمينه اي و نوكلئوتيدي با روش ‭Neighbour- joining ‬و ‭Maximum parsimony ‬انجام شد. درختهاي ترسيم شده در هر دو روش داراي توپولوژي مشابه و داراي حمايت بوت استرپ بالا بودند و بيشترين شباهت ابتدا به پستانداران و سپس به مارماهي شكلان مشاهده شد. براي بيان ژن رشد در باكتري، قسمت بالغ ژن تكثير شد و در وكتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬مطابق با جايگاه برشي ويژه كلون گرديد. سپس در وكتور بياني ‭pET‬‮‭21‬‭a ‬ساب كلون گرديد و براي ترانسفورماسيون باكتري بياني ‭E. coli BL‬‮‭21‬ مورد استفاده قرار گرفت. نتايج نشان داد كه با القا كردن با ‭IPTG ‬، هورمون رشد فيل ماهي بيان گرديد. نتايج ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتينگ نيز باند اختصاصي ‮‭21‬ كيلودالتون براي هورمون رشد را نشان دادند. براي بيان هورمون رشد در مخمر، قسمت بالغ ‭cDNA ‬ابتدا در ‭TA ‬وكتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬كلون گرديد و سپس در وكتور بياني ‭pHILS‬1 ساب كلون گرديد. مخمر ‭Pichia pastoris GS‬‮‭115‬ با پلاسميد نوتركيب ترانسفورم گرديد. نتايج بدست آمده از تحقيق نشان داد كه هورمون رشد نوتركيب با القاگر متانول توليد شده و به محيط كشت ترشح گرديده است. آناليز بيان با استفاده از ‭RNA‬، ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتينگ انجام شد. آناليز ‭RNA ‬باند اختصاصي ‮‭800‬ جفت بازي را نشان داد. سپس ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتينگ باند اختصاصي ‮‭21‬ كيلودالتون را براي هورمون رشد نشان داد.

خلاصه يا چكيده :‬‭In this research we studied the possibility of identification, cloning and expression of great sturgeon growth hormone gene in bacteria and yeast. In the first step to identify growth hormone gene, sampling was done from 3 pituitary gland of mature belug. RNA extracted and cDNA synthesis was done according to submitted growth hormone gene in NCBI. Amplified specific cDNA cloned in pTZ57R and sequenced. The nucleotide sequence of the beluga GH has an open reading frame of 645 nucleotide encoding a protein 214 amino acid residues. The position of the signal peptide cleavage site was predicted to be at position 72. Yielding a signal peptide of 24 amino acids and a mature peptide of 190 amino acids. The phylogenetic analysis was performed based on amino acid residues and DNA using neighbor joining(NJ) and maximum parsimony(MP) methods, phylogenic trees by the two methods are identical in most of the clades with the high bootstrap support, the topology of amino acid residues and DNA sequences showed that the sturgeon has a highest similarity with mammalian and then anguilliform. For expression of growth hormone in E. coli, the mature part of the gene was amplified and cloned in pTZ57R according to specific restriction site. Subsequently subcloned in expression vector pET21a and used to transformation of E. coli BL21. Results showed that, which isopropyl -thiogalactoside (IPTG) induction, recombinant beluga growth hormone has been expressed. SDS-PAGE and western blot analysis showed a specific 21 kDa band for growth hormone. For expression of growth hormone in yeast, the mature cDNA first cloned in TA vector PTZ57R and subsequently subcloned into pHILS1 expression vector. The Pichia pastoris GS115 strain transformed with the recombinant expression plasmid. Results obtained from this study showed that recombinants beluga GH were expressed upon induction with methanol and exported into the medium. Level of expression examined using RNA, SDS-PAGE and western blot analysis. RNA analysis of the recombinant strains showed a sharp specific band in 800 bp. Subsequently SDS-PAGE and western blot analysis showed a specific 21 kDa band for GH.

فيل ماهي , هورمون رشد , مخمر , بيان پروتئين , ‭1 ‭pET‬‮‭21‬‭a , pHILS

تهران موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

بخشي رنگي، جدول، مصور

موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور 48279

كتابنامه: ص. 43- 44

تاس ماهيان , تاس ماهيان- اصلاح نژاد , ماهي‌ ها- ژنتيك مولكولي , نو‌تركيبي پروتئين ‌ها

3742

ب584ع

639