55

جداسازي و شناسايي باكتري هاي موثر در توليد پروبيوتيك از ميگوهاي پرورشي

ميربخش، مريم

افشارنسب، محمد ، همكارطرح , قائدنيا، بابك ، همكارطرح , شريف‌روحاني، مصطفي ، همكارطرح , دشتيان‌نسب، عقيل ، همكارطرح , يگانه، وحيد ، همكارطرح , كشتكار،عيسي ، همكارطرح , نظاري، محمدعلي ، همكارطرح , صدريان، منصور ، همكارطرح , اخوان‌سپهي، عباس ، همكارطرح , لياقت، مجتبي ، همكارطرح , خنافري، آنيتا ، همكارطرح

1393

وزارت ﺟﻬﺎد ﮐﺸﺎورزي - ﺳﺎزﻣﺎن ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت، آﻣﻮزش و ﺗﺮوﯾﺞﮐﺸﺎورزي - ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر

صنعت تكثير و پرورش ميگو به ويژه گونه پا سفيد ‭(Litopenaeus vannamei) ‬يكي از فعاليت هاي عمده آبزي پروري در كشورهاي جهان از جمله ايران مي باشد ولي بروز بيماري ها از عوامل اصلي محدود كننده افزايش توليد مي باشد و با توجه به اثرات سوء استفاده نادرست آنتي بيوتيك ها و مواد شيميايي، كنترل و پيشگيري از بروز بيماري ها نياز به اقدامات نويني دارد كه مقرون به صرفه، موثر و ايمن براي محيط و انسان باشند. لذا اين پژوهش با هدف جداسازي و شناسايي مولكولي پروبيوتيك هاي باكتريايي از دستگاه گوارش ميگوي پا سفيد و محيط زيست آن انجام شد. براي اين منظور در طي پنج ماه از سه سايت اصلي پرورش ميگوي استان بوشهر، نمونه برداري از ‮‭150‬ قطعه ميگوي پرورشي پا سفيد و ‮‭135‬ نمونه آب و رسوب از استخر و كانال هاي ورودي و خروجي به روش استاندارد صورت گرفت و در كليه مراحل نمونه گيري، فاكتورهاي فيزيكوشيميايي آب، ثبت و بيومتري ميگوها انجام شد. جداسازي پروبيوتيك ها از نمونه هاي فوق، به روش كشت بر روي محيط هاي تريپتيك سوي آگار و ‭TCBS ‬پس از گرمخانه گذاري در دماي ‮‭30‬ درجه سانتيگراد به مدت ‮‭24-48‬ ساعت انجام شد و اثر ضدميكروبي عصاره محيط كشت جدايه هاي فوق بر روي باكتري ‭Vibrio harveyi ‬به روش انتشار در آگار مورد ارزيابي قرار گرفت و بهترين جدايه ها گزينش گرديد. شناسايي باكتري هاي منتخب با روش توالي يابي ‮‭16‬‭S rDNA ‬انجام شد. سينتيك رشد باكتري هاي منتخب و اثر عوامل محيطي بر توليد تركيبات ضدميكروبي و ماندگاري آنها به ترتيب در شرايط شوري (%‮‭1/5-5/5‬) و(‮‭9-5‬‭) ppt‬‮‭0-50‬)، ‭pH) ‬و دماي(؛‮‭30‬‭-C‬‮‭40‬) و (؛‮‭35‬‭-C‬‮‭100‬) مورد بررسي قرارگرفت و پروفايل مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري هاي منتخب تعيين گرديد. استخراج مواد زيستي توليد شده توسط باكتري هاي منتخب به روش دياليز و تعيين هويت آنها به روش هاي ‭SDS-PAGE ‬الكتروفورزيس، طيف سنجي ماوراي بنفش و گاز كروماتوگرافي جرمي انجام شد. نتايج حاصل از اين پژوهش، بيشترين فراواني باكتري هاي هتروتروف هوازي و بي هوازي اختياري را در دستگاه گوارش ميگو ها ‭CFU/g‬‮‭105‬أ (‮‭3/04 0/75‬) در ماه مهر نشان داد. جنس %‮‭88/37‬‭) .Vibrio spp) ‬و %‮‭27/27‬‭) .Bacillus spp) ‬به ترتيب داراي بيشترين فراواني ارزيابي شدند. از ميان ‮‭198‬ باكتري جداسازي شده، دو سويه جداسازي شده از دستگاه گوارش و رسوب استخر كه بيشترين ميزان بازدارندگي رشد و پايداري در برابر باكتري ‭V.harveyi ‬را داشتند، انتخاب گرديدند. براساس توالي يابي ‮‭16‬‭S rDNA ‬اين باكتري ها به ترتيب ‭Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain IS‬‮‭02‬ ‭(GenBank: JN‬‮‭1.856456‬) و ‭Bacillus vallismotis IS‬‮‭03‬ ‭(GenBank: JQ‬‮‭1.085958‬) شناسايي و در بانك جهاني ژن ثبت شدند. بر اساس نتايج حاصل از تعيين هويت مواد زيستي توليد شده توسط باكتري هاي منتخب در ‭SDS-PAGE ‬الكتروفورزيس، باكتري ‭Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain IS‬‮‭02‬ هيچ باندي نشان نداد و باكتري ‭Bacillus vallismotis IS‬‮‭03‬ دو باند در محدوده وزن مولكولي ‮‭25‬ كيلو دالتون و ‮‭35-45‬ كيلو دالتون ايجاد كرد كه احتمالا به ترتيب مربوط به شبه باكتريوسين ها و گروه ‭III ‬باكتريوسين هاي باسيلوسي مي باشند. طيف حاصل از عصاره باكتري هاي منتخب نيز در محدوده (‮‭265-260‬ ‭nm) ‬بيشترين پيك را داشت كه مربوط به گروه هاي پپتيدي مي باشد و همچنين در آناليز ‭GC-MS ‬بيشترين درصد پيك كروماتوگرام هر دو باكتري مربوط به ‭pyrrolopyrazines ‬بود كه داراي خواص آنتي باكتريال است. در مجموع با توجه به نتايج حاصل از اين پژوهش مي توان اظهار داشت كه هر دو باكتري سازگاري بسيار خوبي با شرايط اكولوژيك زيستگاه هاي تكثير و پرورش ميگو داشته و مي توان از آن ها به عنوان پروبيوتيك مناسب در اين صنعت استفاده نمود و اميد است به كمك نتايج اين پژوهش گامي در جهت تحقق توليد ملي پروبيوتيك بومي در كشور ايران برداشت.

‭Shrimp culture and rearing industry in particular white leg shrimp species (Litopenaeus vannamei) is one of the major activities in the world, including Iran. The outbreaks of diseases are the main factors limiting production. Due to the adverse effects of abusing antibiotics and chemical disinfectants, disease control and prevention requires novel methods that are affordable, effective and safe for the environment and humans. For this purpose during the five months, sampling was done from three main sites of shrimp culture in Bushehr province and 150 pieces cultured white leg shrimp, 135 water and sediment samples were collected from the ponds, input and output channels by standard methods. Physicochemical parameters of water and biometry of shrimps were done and recorded. Probiotic isolation was performed by culturing samples in Tryptic soy agar and TCBS after incubation in 30‬؛ ‭C for 24-48 h. The antimicrobial effects of culture extract of isolates were evaluated against V. harveyi with the well diffusion method and the best isolates were selected. The molecular identification of selected bacteria was performed by 16S ribosomal DNA gene sequence analysis technique. The growth kinetics of selected bacteria and effect of environmental factors on antimicrobial compound production and stability of them in salinity (1.5-5.5%) and (0-50ppt), pH (5-9) and temperature (30-40‬؛ ‭C) and (35-100‬؛ ‭C) were studied respectively. After the determination of antibiotic resistance profiles of them, the In vivo test on the L. vannamei post larvae was performed and effect of these bacteria on growth performance, prevention of vibriosis and water quality include (ammonia, nitrate nitrite, turbidity, total bacteria and Vibrionaceae load were examined. For extraction and identification of bioactive material with anti-bacterial properties produced by selected bacteria, dialysis, SDS-PAGE electrophoresis, ultraviolet spectroscopy and gas chromatography mass was performed. According to the results of this dissertation the most frequency of facultative aerobic and anaerobic heterotrophic bacteria was seen in shrimp digestion tract (3.04 0.75) 105‬أ ‭CFU/g in September. Genus Vibrio spp. (37.88%) and Bacillus spp. (27.27%) had the most frequency respectively. Of the 198 bacterial isolates, two bacterial strains from the digestive tract and sediment which had the highest inhibition and a stability antagonistic effect on V. harveyi were selected. Based on 16S ribosomal DNA gene sequence analysis, they were identified as Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain IS02 (GenBank: JN856456.1) and Bacillus vallismotis IS03 (GenBank: JQ085958.1) and recorded in the National Center for Biotechnology Information (NCBI). According to results of identifying bioactive material produced by selected bacteria, in SDS-PAGE electrophoresis Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain IS02 did not have any band but Bacillus vallismotis IS03 had two band in 25 kDa and 34-45 kDa molecular weight which probably bacteriocin like substances and group III Bacillus bacteriocin respectively. UV spectra of selected bacteria were in the range (260-265nm) which related to peptide groups. In GC-MS the highest percent of chromatogram was belonged to pyrrolopyrazines in both of selected bacteria, which have antibacterial properties. Overall, according to results both of the selected bacteria were adapted to the ecological conditions of shrimp culture and could be used as appropriate probiotics in this industry. It is hoped that the results of this research is to produce a step towards the realization of national production of indigenous probiotic in Iran

ميگوهاي پرورشي , جداسازي و شناسايي , باكتري هاي موثر , توليد پروبيوتيك

تهران موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

جدول، رنگي، مصور، نمودار

موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور. پژوهشكده ميگو 43360

كتابنامه: ص. 168- 177

م‍ي‍گ‍و- پ‍رورش‌ و ت‍ك‍ث‍ي‍ر , آبزي‌ پروري , آبزيان- ميكرب‌ شناسي , پروبيوتيك ‌ها

68

ج 928 م

639