بهينه‌سازي انحلال پروتئين نوتركيب اينترفرون بتا توليد شده به صورت اينكلوژن‌بادي و بازتاخوردگي مجدد آن

Optimization of solubilization of interferon beta b-1 from inclusion bodies and refolding of it

توليد داروهاي نوتركيب به خاطر تشكيل اينكلوژن‌بادي ناشي از بيش بيان پروتئين نوتركيب با دشواري‌هاي همراه است. بيان اينترفرون بتا 1-b در باكتري اشريشيا كلاي به شكل يك پروتئين غيرگلايكوزيله شده است كه داخل سلول به صورت اينكلوژن‌بادي تجمع مي‌يابد. اينكلوژن‌بادي‌ها غيرفعال و نامحلول هستند. به منظور به دست آوردن پروتئيني زيست‌فعال، نياز به حل كردن اينكلوژن‌بادي‌ها با استفاده از عوامل واسرشته كننده و سپس حذف اين عوامل در حضور بافر بازتاخوردگي مناسب است. انحلال اينكلوژن‌بادي‌ها با يك روش مناسب، در فرايندهاي پايين دستي پروتئين‌هاي توليد شده به صورت توده‌هاي درون‌سلولي از اهميت زيادي برخوردار است. هدف اين تحقيق مقايسه بافرهاي انحلال متفاوت براي حل كردن اينكلوژن‌بادي اينترفرون بتا 1-bاست. بهينه‌سازي انحلال براي مقدار مشخص اينكلوژن‌بادي در پروسه خالص‌سازي و بازتاخوردگي پروتئين نوتركيب نقش مؤثري دارد. انحلال اينكلوژن‌بادي‌ها تحت شرايط متفاوت با استفاده از اس دي اس و حلال‌هاي آلي متفاوت در شرايط ويژه pH انجام شد. تركيب‌هاي مختلفي از اس دي اس با حلال‌هاي آلي براي انحلال اينكوژن‌بادي اينترفرون بتا 1-b مورد آزمايش قرار گرفت كه بهترين نتيجه با محلول انحلال حاوي 1% اس دي اس به همراه 5/37% 1-پروپانول و 15% 2- بوتانول با 2 = pH به دست آمد. اين بافر توانست به صورت موثر اينكلوژن‌بادي را با خلوص بالاي اينترفرون بتا1-b حل نمايد. به‌طور عمومي، راه‌كارهاي بازتاخوردگي اين توده‌هاي پروتئيني شامل دياليز، رقيق‌سازي و روش‌هاي روي ستون مي‌شود كه از اين ميان روش رقيق‌سازي بافر بازتاخوردگي به درون پروتئين واسرشته مورد استفاده قرار گرفت. بازتاخوردگي اينترفرون در غلظت 3 ميلي‌مولار سيستين و 5/8 = pH انجام شد. در اين شرايط، بازده بازتاخوردگي اينترفرون معادل 60% به‌ دست آمد كه در مقايسه با مطالعات پيشين، نتيجه مطلوبي است.

Formation of inclusion bodies is a challenge in producing recombinant protein bodies. In order to reach an active protein dissolving with denaturant agent and eliminate these factors during refolding process is needed. The aim of this study was to compare different solubilization buffers for dissolving the inclusion bodies of interferon beta 1-b produced in recombinant E. coli BL21. Optimization of solubilization of inclusion bodies is an important step during optimization of downstream process. Protein expressed in the form of inclusion body were dissolved using several chaotropic agent such as urea, surfactant detergent such as SDS, and tree different alkyl alcohols solvent. Inclusion bodies were solubilized by different type of buffers in pH 2. The samples were centrifuged and recombinant protein concentration of each supernatant was measured with Bradford assay and SDS-PAGE. The results indicate an optimum solubilization buffer by containing 1% SDS, 37% 1-propanol and 15% 2-buthanol. Refolding of Interferon beta 1-b occurred in pH 8.5 by refolding buffer containing 3 mM cyctine. Results also show 60% efficiency of refolding process.