بيان پروتئين نوتركيب انتروتوكسين كلستريديوم پرفرينجنز در باكتري E. coli و بررسي ويژگي هاي مولكولي آن

Expression of Clostridium perfringens enterotoxin gene in E. coli and it’s molecular propertie’s survey

باكتري كلستريديوم پرفرينجنز (C. perfrinjens) يك باسيل گرم مثبت بي هوازي غيرمتحرك وداراي كپسول به طول 2تا4 ميكرون و عرض 5/0 تا 5/1 ميكرون است. باكتري C. perfrinjens سبب ايجاد طيف وسيعي از بيماري هايي شامل مسموميت غذايي، گانگرن گازي، انتريت نكروزي، عفونت هاي معدي- روده اي با منشاء غيرخوراكي در انسان و انتروتوكسمي، قلوه نرمي و عفونت هاي سيستم گوارشي در دام بوده كه مي تواند به سرعت منجر به مرگ شود.17 نوع اگزوتوكسين توسط باكتري C. perfrinjens توليد مي شود كه 4 توكسين اصلي آن؛ آلفا، بتا، اپسيلون و يوتا مي باشد و توكسين هاي فرعي به نام هاي سيگما، تتا، كاپا، لامبدا، مو، نو، نوآميداز و انتروتوكسين مي باشد. عامل بسياري از مسموميت هاي غذايي اين باكتري, انتروتوكسين كلستريديوم پرفرينجنز (Clostridium perfringens entrotoxin (CPE)) است كه در مسموميت هاي غذايي و بيماري هاي گوارشي نقش دارد. در پيشينه اين پژوهش باكتري فريزدراي شده تيپ D و C در محيط مناسب كشت داده شده و DNAژنومي با روش فنول كلروفرم و پلاسميد با استفاده از كيت تخليص پلاسميد, استخراج گرديد و به منظور تكثير ژن انتروتوكسين واكنش PCR انجام گرفت. ژن حاصل در وكتور pTG19-T لايگيت و محصول لايگيشن به سويه TOP10 باكتري E. coli ترانسفورم گرديد. در پژوهش حاضر وكتور نوتركيب از باكتري نوتركيب E.coli/Top10/pTG.ent استخراج شد و ژن انتروتوكسين از وكتور نوتركيب حاوي ژن انتروتوكسين به روش برش آنزيمي استخراج و به وكتور بياني pET22b+ لايگيت و محصول لايگيشن به باكتري ميزبان E. coli/Rosseta ترانسفورم شد. براي تاييد حضور ژن انتروتوكسين در ميزبان فرآيندColony PCR انجام شد. با استخراج پلاسميد نوتركيب توالي يابي ژن انترو توكسين به منظور تائيد صحت وكتور بياني نوتركيب انجام شد كه با توالي موجود مطابقت داشت. پروتئين توكسين انتروتوكسين در باكتري نوتركيب pET.ent/E. coli/Rosseta بيان و با روش SDS-PAGE و Western blot تاييد گرديد.

Clostridium perfringens is a gram-positive, obligate anaerobic bacterium, which is widely distributed in the environment. C. perfringens is subdivided into five groups (types A to E), based on its four major toxin (alpha, beta, epsilon and iota) Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) an important virulence factor causes the symptoms associated with several common gastrointestinal diseases. The cpe gene was shown to encode a 319-amino-acid polypeptide with a deduced molecular weight of 35,317.In the present study, The cpe gene had been cloned in E. coli/TOP10, pTG.ent recombinant plasmid was extracted from recombinant bacterium host and Eneterotoxin gene was extracted by using restriction enzymes. Enterotoxin gene was ligated in pET22b(+) expression vector. The ligation product was transformed using E. coli/Rosetta competent cells and the recombinant pET22.ent clones were chosen on LB-amp. Enteroptoxin protein was expressed after IPTG induction. Expression was evaluated using Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blot. We concluded that enterotoxin gene of Clostridium perfringens type D was expressed in E. coli/Rosetta/pET22.ent recombinant clone as well and it can be used as a recombinant protein in the manufacture of recombinant vaccines.