كلونينگ، بيان و بررسي فعاليت پروتئين استرپتوكينازحاوي موتاسيون در دومين هاي آلفا، بتا وگاما

استرپتوكيناز يكي ازمهمترين داروهاي مورد استفاده درمان گرفتگيهاي عروق خوني مي باشد اما باوجود برتري نسبت به داروهاي ترومبوليتيك ديگر ،عوارضي مانندواكنشهاي آلرژيك ايجاد كرده ونياز به افزايش نيمه عمر آن در بدن مي باشد. يكي از راههاي كاهش اين مشكلات، پگيلاسيون اختصاصي(اتصا ل پليمر صناعيPEG) روي اسيدآمينه سيستئين مي باشد. درپروژه هاي قبلي سه پروتئين موتانت حاوي سيستئين (موتاسيون دراسيدآمينه هاي 45، 263 و 319) طراحي ومشخص گرديد كه هرسه فعاليت بيولوژيك مناسبي داشته وبراي پگيلاسيون اختصاصي قابل استفاده اند. هدف ازاين تحقيق ايجاد استرپتوكينازي است كه هر سه موتاسيون رادر يك رشته داشته وفعاليتش باپروتئين دست نخورده مقايسه گردد. ابتد اژن حاوي سيستئين ۴۵به عنوان الگو انتخاب و با SOEingPCR در جايگاه 263، موتاسيون ايجاد شد. پس از تاييد ايجاد موتاسيون با تعيين توالي، موتاسيون دوم با همان روش در جايگاه 319 ايجاد شد. ژن حاوي سه موتاسيون (SKC3) درpET26-b كلون و سازه حاصل در سويه RosettaE.coli ترنسفورم شده وSKC3 توسط القاء با IPTG بيان شد. بيان پروتئين با SDS-PAGE و وسترن بلات بررسي و بوسيله افينيتي كروماتوگرافي تخليص شد. فعاليت سنجي SKC3 در مقايسه با پروتئين دست نخورده (Ski) به روش كروموژنيك انجام شد. پارامترهاي كينتيكي حاصل شامل Vmax،Km،Kcat وبازده فعاليت آنزيمي محاسبه گرديد. Km دو پروتئين بسيار نزديك به هم بود اما VmaxوKcat SKC3 از Ski بيشتر بوده و نهايتا بازده آنزيمي حدود 15٪ افزايش نشان داد. بطوركلي نتايج اين تحقيق نشان داد SKC3فعاليت بيولوژيك مناسبي داشته ومي تواند كانديد مناسبي براي پگيلاسيون اختصاصي معرفي گردد.