بهينه سازي تكنيك SOEing (Splicing Overlap Extension) PCR براي ايجاد موتاسيون هدفمند دراسترپتوكيناز نوتركيب

Optimization techniques SOEing (Splicing Overlap Extension) PCR to create targeted mutations recombinant Streptokinase

يكي از مهمترين تكنيك هاي مورد استفاده در ايجاد موتاسيون هدفمند در ژن ها، استفاده از تكنيك SOEing PCR مي باشد. برخلاف سادگي اين تكنيك گاهي براي ايجاد موتاسيون در نقاط خاصي از يك ژن مشكل ايجاد مي مي شود. در اين تحقيق موتاسيون هدفمند براي ايجاد اسيدآمينه سيستئين در جايگاه اسيدگلوتاميك 263 استرپتوكيناز با تكنيك SOEing PCR و بهينه سازي آن انجام شد. از نرم افزار GENERUNNER براي طراحي پرايمر هاي لازم براي تكثير و و ايجاد موتاسيون استفاده شد. براي ايجاد موتاسيون به روشSOEing PCR ابتدا قطعات همپوشان داراي موتاسيون تكثير شدند و براي ايجاد ژن كامل، قطعات با هم مخلوط شده و با تكنيك PCR تكثير شدند. براي بررسي درستي اندازه و غلظت ژن از روش الكتروفورز و اسپكتروفوتومتري با نور UV استفاده شدو براي بررسي درستي ايجاد موتاسيون، ژن موتاسيون يافته تعيين توالي شد. با افزايش غلضت بافر استفاده شده در اين تكنيك، غلظت محصول موتاسيون يافته و همچنين ميزان وضوح باند ها پس از الكتروفورز، در مقايسه با روش استفاده از غلظت معمول (1X)، به مقدار زيادي افزايش يافت. استفاده از اين پروتكل براي انجام SOEing PCR باعث توليد غلظت بالايي از محصول جهش يافته شد. باتوجه به اين كه غلظت و خلوص محصول موتاسيون يافته براي انجام مطالعات بعدي مهم مي باشد نتايج اين مطالعه براي محققين استفاده از اين تكنيك بسيار مفيد خواهد بود.

One of the most important techniques used for site directed mutation, is SOEing PCR. Unlike the simplicity of the technique, sometimes, some problem may arise during mutation generation in a specific locus of a gene.In this study site directed mutation for cysteine exchange with glutamic acid 263 of streptokinase was carried out by SOEing PCR, and optimized. GENERUNNERsoftware was used for primer design,required for mutation generation and gene multiplication.To create mutation by SOEing PCR method, at first the overlapping parts which contained mutation, were multiplicated and to create the complete gene, the fragments were mixed togetherand amplified by PCR. Electrophoresis and spectrophotometery by UV light was used to verify the size and concentration of the gene and to verify the accuracy of mutation creation, the mutated gene was sequenced. By increasing the PCR buffer concentration, the mutant product concentration was greatly increased and as well, the resolution of the mutated DNA bands after electerophoresis was improved greatly when compared with the typical concentration (1X).The use of this protocol for SOEing PCR leads to production of mutated genes with high concentration. Noting that a high concentration and purity of mutatated products is neccesary for further studies, the results of this study will be very helpful for researchers using this technique.