كلونينگ آنزيم فسفوليپاز باكتريايي ناتريالبا آسياتيكا در وكتور pET-28a

فسفوليپاز (كربوكسيل استراز EC 3.1.1 ) آنزيمي است كه پيوندهاي استري آبگريز تري گليسرول و فسفوليپيدها را، هيدروليز مي كنند . اين آنزيم همچنين مجموعه اي از واكنش هاي ديگر را كاتاليز مي كنند . بعنوان مثال : آسيل ترانسفراز، ترانس آسيلاز و فعاليت هاي ترانس فسفوتيداسيون . آنزيم فسفوليپاز جز كاتاليزورهاي حياتي چند منظوره است كه به طور گسترده اي در برنامه هاي مختلف صنعتي استفاده مي شود، از جمله براي بيوديزل، مواد غذايي، مواد افزودني بيولوژيكي فعال، صمغ ، نفت و مواد شوينده . و همچنين در صنعت توليد لوازم اصلاح زيستي، كشاورزي، لوازم آرايشي، چرم و كاغذ كاربردي جزئي نيز دارند. اين آنزيم در بيشتر موجودات زنده در سراسر حيوانات، گياهان، مخمرها، قارچ ها و باكتري وجود دارند. همچنين به نظر مي رسد فسفوليپازهاي ترشحي ، عامل كليدي حدت اثرات پاتوفيزيولوژيك هستند، كه در باكتري موجب كمك به بقا يا توزيع باكتريايي بدون ايجاد تخريب بافتي مي گردند . توسعه روش هاي مولكولي براي توليد پروتئين هاي نوتركيب در سيستم هاي ميزبان ناهمگون، بر محدوديت هاي تكثير غلبه كرده است. چرا كه اجازه مي دهد تا پروتئين در سطح بالا بيان شود و آنزيم هاي جديد با خواص كاتاليزوري بهبود يافته ، طراحي و توليد شوند. در پژوهش حاضر، ژن فسفوليپاز از آركي نمك دوست ناتريالبا آسياتيكا با روش PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي (شامل سايت هاي برش EcoRI و HindIII) تكثير گرديد. پلاسميد pET-28a بعنوان وكتور كلونينگ ، از باكتري E.coli سويه DH5α استخراج گرديد . سپس پلاسميد و ژن فسفوليپاز توسط آنزيم هاي محدودالاثر ذكر شده ، هضم و الحاق شدند. PET-28a حاوي ژن فسفوليپاز به سلول E.coli DH5a منتقل گرديد . غربالگري با استفاده از محيط كشت جامد LB-آگار حاوي كانامايسين انجام شد . ژن فسفوليپاز نوتركيب با استفاده از هضم دوگانه مورد آزمايش قرار گرفت. در نهايت تعيين توالي نوكلئوتيدي با استفاده از پروموتر T7 شركت ماكروژن كره تاييد گرديد .