توليد رده سلولي پايدار جهت بيان ژن فسفوليپاز A2 زهر زنبور عسل (آپيس مليفرا)

Generation of stable cell line for production of honey bee (Apis mellifera) phospholipase A2

بيان مسئله: در زهر زنبور عسل آنزيم هاي مختلفي مانند فسفوليپازA2، هيالورونيداز، .اسيد فسفاتاز، ... ) وجود دارد كه آنزيم فسفوليپاز يكي از فراوان ترين آن ها است. لذا افزايش اطلاعات در رابطه با اين آنزيم مي تواند براي صنعت داروسازي مفيد باشد. از آن جايي كه اين آنزيم يكي از كشنده ترين اجزاي سم حشرات و خزندگان مي باشد و همچنين در زهر زنبورعسل بعنوان آلرژن مطرح است لذا توليد آن توسط ايجاد رده هاي سلولي پايدار جهت مطالعات فارماكولوژيك ضروري مي باشد. در صورت نياز به بيان مداوم ژن، توليد سل لاين هاي پايدار مورد نياز است. تهيه لاين هاي سلولي پايدار جهت تهيه پروتئين‌هاي نوتركيب دارويي، تحقيقاتي و تشخيصي و آنتي بادي هاي مونوكلونال در سطوح بالا بخش مهمي از تحقيقات داروسازي را به خود اختصاص مي دهد. كه بطور قابل ملاحظه اي سبب صرفه جويي در وقت و هزينه مي گردد و سبب بيان ژن موردنظر بطور مداوم و كنترل شده مي گردد. هدف پژوهش: توليد رده سلولي پايدار جهت بيان فسفوليپازA2 زهر زنبور عسل ( آپيس مليفرا) روش كار: اين پروسه شامل سنتز ژن و طراحي وكتور، ترانسفكشن و جاي گيري توالي ژن مورد نظر داخل ژنوم و انتخاب اين سلول ها بر اساس مقاومت انتي بيوتيكي، غربالگري ازدياد و تكثير كلون هاي انتخاب شده و تخليص پروتئين ها مي باشد. پس از سنتز ژن فسفوليپاز A2و قرار دادن آن در وكتور PCDNA توسط كمپاني ماكروژن اقدام به ازدياد پلاسميد در باكتري اشرشياكلاي گرديد. سپس ترانسفكت نمودن سلول‌هاي CHO، با پلاسميد حاوي ژن با روش كلرور كلسيم و بيان ژن در محيط كشت هامز اف 12 حاوي آنتي بيوتيك نئومايسين. در سه مرحله تعيين غلظت مناسب آنتي بيوتيك، ترانسفكشن و انتخاب و ازدياد كلون هاي حاوي پلاسميد انجام پذيرفت. بطور معمول اغلب سلول هايي كه پلاسميد وارد ان ها نشده است مي ميرند ولي سلول هاي حاوي پلاسميد بعد از 9 روز زنده مي مانند. پس از اين كه پليت كاملا از سلول پر شد سلول ها مي‌توانند بعنوان رده پلي كلونال در نظر گرفته شوند. سپس اين رده هاي پلي كلونال توسط تكنيك رقت محدود (limiting dilution) در پليت هاي 96 خانه اي كشت داده مي شوند تا بتوان كلون هاي مونوكلونال را انتخاب نمود و بسط داد. در نهايت اقدام به جمع آوري و تغليظ سوپ سلول هاي انتخاب شده و انجام SDS-PAGE جهت بررسي و بيان پروتئين مذكورگرديد. يافته ها و نتيجه گيري: در آزمايش الكتروفورز كه بمنظور تاييد بيان ژن فسفوليپازA2 در سوپ سلول ها انجام پذيرفت باندي قابل انتظار با وزن مولكولي حدود 20 كيلودالتون بدست آمد كه با گزارشات ديگر محققين در اين خصوص مطابقت داشته است. از آن جايي كه فسفوليپاز A2 از تركيبات مهم توكسيك و آلرژيك زهر زنبورعسل مي باشد لذا مطالعات تشخيصي و درماني در رابطه با اين آنزيم نياز به پروتئين كافي و خالص دارد. توليد نوتركيب اين پروتئين نيازمند فراهم سازي رده هاي سلولي پايدار مي باشد تا بتوان بصورت كنترل شده و مداوم و با صرف كمترين وقت و هزينه اقدام به توليد مقادير مناسب پروتئين نمود. integration جاگيري توالي دي ان اي خارجي به داخل ژنوم سلول يوكاريوتِ مي تواند از طريق بكارگيري سيستم هاي تغيير و ترميم دي ان اي اندوژن انجام پذيرد.