جداسازي و مطالعه سويه هاي استافيلوكوكوس عامل بيماري شانكر باكتريايي درختان هسته دار در استان فارس

Isolation and characterization of Staphylococcus isolates as causal agents of stone-fruit canker disease from Fars

بيماري شانكر باكتريايي يكي از مهم¬ترين بيماري¬هاي درختان ميوه هسته¬دار مي¬باشد كه سبب ايجاد زخم هاي فرورفته تيره رنگ همراه با تراوش صمغ بر روي شاخه¬ها مي¬شود. بر اثر شانكر ارتباط قسمت بالاي گياه با بخش-هاي پايين¬تر قطع شده، برگ¬ها پيچيده، آويزان، سبز روشن و سپس زرد مي¬شوند. به منظور بررسي شناسايي ميكروارگانيسم¬هاي دخيل در شانكر درختان ميوه هسته¬دار نمونه برداري از باغات شمال فارس در بهار 1394 انجام گرديد. ساقه¬هاي آلوده با آب شسته شد. قطعات داراي علايم پوست ساقه در آب مقطر استريل در ظرف پتري با تيغ خرد گرديد. پس از 20 دقيقه نگه¬داري در دماي اتاق، چند لوپ از سوسپانسيون بدست آمده در سطح محيط آگار غذايي حاوي دو درصد سوكروز مخطط گرديد. بعد از چند روز تك كلني¬هاي شيري تا سفيد كه به صورت لايه¬اي نازك بودند رشد كردند. از كلني¬ها سوسپانسيوني تهيه و به زير پوست درختان مورد نظر تزريق گرديد و بعد از حدود 7-10 روز علايم ظاهر شد. جدايه¬هاي مايه¬زني شده به ساقه¬ها دوباره از شانكر¬هاي ايجاد شده جدا گرديد. با استفاده از آغازگر rpoB حدود bp1000از پليمراز تكثير و توالي¬يابي شد. توالي¬هاي بدست آمده با استفاده از نرم¬افزار بلاست در ژن بانك با توالي¬هاي موجود در اين پايگاه مقايسه و ميزان شباهت آن¬ها تعيين گرديد. با مقايسه توالي rpoB در ژن بانك جدايه¬هاي مورد نظر بيشترين شباهت را به Staphylococcus داشته¬اند. جدايه¬ها كند رشد و كلني آن¬ها به صورت ورقه¬اي و نازك شيري تا زرد رنگ بود. جدايه¬ها اكسيداز منفي و كاتالاز مثبت هستند، نمك 10 و 12 و 15 راتحمل كردند.

Bacterial canker is one of the most important diseases of the stone-fruit trees, causing which forms brown sunken lesios with gum exodation twigs and branches. The leaves lose their turgidity and turn to pale yellow and wilt. To identify the microorganisms involved in stone-fruits canker, samples were collected from fruit-bearing trees northern Fars in the spring ofsegments 2017. The infected stems were washed with running tap water.Segments of the bark with disease symptoms were crushed indrops of sterile water in a plate. After 20 minutes of storage at room temperature, loopfuls of suspension were plated on the surface of nutrient agar medium containing 2% sucrose(NAS). Then single colonies with milky to white color were grown on NAS. Water Saspensions of the strains were prepared and injected under the bark of twings of one-years old trees. characferistic symptoms appeared 7-10 days inoculation. The bacteria were then isolated from canker in inoculated strains were reisolated from the moculated sites. phenotypic tests were carried out to characterize the isolates. Molecular identification was performed using polymerase chain reaction. Using the rpoB primer, the desired fragment was amplified and sequenced. The sequences were compared using a blast software in NCBT database. By comparing the rpoB sequence, the isolates were highly similar to Staphylococcus sp. The isolates had a slow growth rate and grew as flat white to yellow colonies on nutrient agar . The isolated were Gram-positive cocci ,oxidase negative , catalase positive and gram on media containing 12-15 % nacl.