بررسي تاثير بيان همزمان چاپرون هاي DnaK و DnaJ با كربونيك انيدراز بر ميزان حلاليت آن در باكتري E. coli

A novel bacterial co-expression system with DnaK and DnaJ chaperones for over- expressing soluble Carbonic anhydrase

در اين تحقيق عملكرد چاپروني DnaK و DnaJ بر روي ميزان حلاليت آنزيم كربونيك انيدراز (CA) در يك ميزبان بياني مناسب، با بيان هم زمان ژن هاي مذكور با ژن هدف بررسي شد. به دليل استفاده از داروهاي مهاركننده آنزيم كربونيك انيدراز در درمان گلوكوم و همچنين تومورهاي سرطاني، توليد انبوه اين آنزيم در بيوتكنولوژي مدرن مورد توجه است، گرچه توليد انبوه آن در سلول ميزبان با مشكلاتي همچون تشكيل اجسام تجمعي و غيرفعال مواجه خواهد شد. جهت رفع مشكل مي توان از پروتئين هاي كمكي با نام چاپرون هاي مولكولي استفاده كرد. در اين مطالعه ژن كربونيك انيدراز و ژن هاي چاپروني DnaJ وDnaK از سويه Bacillus cereus با پي سي آر تكثير شده و پس از T/A كلون، به ترتيب در وكتورهاي بياني pET19b و pET28a كلون شدند و در نهايت به ميزبان بياني E. coli سويه BL21 منتقل شدند. با انجام SDS-PAGE ميزان بيان پروتئين ها مورد ارزيابي قرار گرفت، نتيجه حاكي از آن بود كه ژن چاپروني DnaK كه نقش اصلي را در سيستم چاپروني خانواده Hsp70 به عهده دارد، بر روي حلاليت كربونيك انيدراز موثر بوده ولي ژن DnaJ كه نقش كمكي را در عملكرد صحيح DnaK در اين سيستم چاپروني بازي مي كند، نتوانست به تنهايي بر حلاليت بيشتر اين آنزيم تاثيرگذار باشد.

The present study assessed the effect of DnaK and DnaJ chaperones on solubility level of Carbonic Anhydrase (CA) protein which co- expressed in an appropriate expression host with the target gene. Due to the use of Carbonic anhydrase inhibitors in the treatment of Glaucoma as well as cancerous tumors, the mass production of this enzyme is highly considered in modern biotechnology. However, the expression of Carbonic Anhydrase in a variety of host cells come across with some difficulties such as insoluble and/or nonfunctional proteins that called “Inclusion bodies”. In order to overcome this problem, assistant proteins called “molecular chaperones” can be used. In this study, The CA gene and DnaJ and DnaK chaperoning genes of Bacillus cereus strain as a template, were amplified by PCR and the amplified fragments were first T/A cloned and then cloned into pET19b and pET28a expression vectors respectively. Recombinant expression vectors were subsequently transformed into E. coli BL21. Expression level of the proteins was inspected on SDS-PAGE. The results revealed that the DnaK chaperone gene, which plays the major role in the chaperone system of Hsp70 families, positively affects the solubility of Carbonic anhydrase. Nonetheless, the DnaJ gene, which contributes to the proper functioning of DnaK in chaperone systems, was not able alone to enhance the solubility of the target protein.