بيان و تخليص پروتئين نوتركيب TolC از باكتري شيگلا فلكسنري و بررسي ايمني زايي آن در موش آزمايشگاهي

Expression and purification of TolC as a recombinant protein vaccine against Shigella flexneri and evaluation of immunogenic response in mice

باكتري شيگلا عامل نوعي اسهال خوني است كه شيگلوز نامييده مي‌شود. شيگلوز سالانه باعث ۱۶۰۰۰۰ مورد مرگ و مير در سطح جهان و عمدتا كودكان زير ۵ سال است. تاكنون هيچ واكسن مجازي عليه آن در دسترس نيست. واكسن‌شناسي معكوس يك استراتژي جديد است كه ژنوم يا پروتئوم ارگانيسم را براي يافتن يك نامزد جديد واكسن اميدواركننده ارزيابي مي‌كند. در اين مطالعه، با استفاده از واكسن‌شناسي معكوس و تست‌هاي آزمايشگاهي، ايمني‌زايي يك آنتي‌ژن نوتركيب براي پيش بيني يك كانديد جديد ايمني‌زا به عنوان واكسن عليه باكتري شيگلا ارزيابي شد. در مرحله اول، پروتئوم Shigella flexneri از UniProtKB تهيه و سپس با استفاده از ارزيابي بيوانفورماتيكي، پروتئين TolC به عنوان كانديد مناسب انتخاب و تاييد شد. در مرحله بعد، توالي ژن tolC به درون پلاسميد ادغام شد و جهت بيان پروتئين TolC به سويه بياني انتقال يافت. سپس پروتئين تخليص شده به دو فرم پروتئين تخليص شده به تنهايي و به همراه ادجوانت به صورت زيرجلدي به موش‌ها تزريق شد. بعد از ايمن كردن حيوانات آزمايشگاهي و خونگيري، افزايش معني داري در تيتر آنتي‌بادي مشاهده شد. چالش موش‌ها با دو دوز مختلف از سوش استاندارد شيگلا فلكسنري انجام شد. ددر مرحله آخر، ميزان مرگ و مير موش‌ها طي ۱۵ روز رديابي شد كه نتايج معني‌داري از درصد زنده‌ماني موش‌هاي ايمن شده پس از تزريق شيكلا فلكسنري به دست امد. از اين رو پروتئين TolC مي‌تواند به عنوان يك پروتئين آيمني‌زا به تنهايي و يا به صورت پپتيد كايمر به عنوان كانديد واكسن عليه عفونت شيگلوز مطرح باشد.

Shigella is one of the major causes of dysenteric diarrhea named shigellosis. Shigellosis infection causes 160,000 deaths annually of diarrheal disease in the global scale especially children less than 5 years old. No licensed vaccine is available against shigellosis. The reverse vaccinology (RV) is a novel strategy that evaluate genome or proteome of the organism to find a new promising vaccine candidate. In this study, immunogenicity of a designed-recombinant antigen is evaluated through the in-silico studies and animal experiments to predict a new immunogenic candidate against Shigella. In the first step, proteome of Shigella flexneri was obtained from UniProtKB and then the outer membrane and extracellular proteins were predicted. In this study TolC as an outer membrane protein was selected and confirmed among candidates. In next steps, pre-selected protein was evaluated for transmembrane domains, homology, conservation, antigenicity, solubility, and B- and T-cell prediction by different online servers. TolC as a conserved outer membrane protein, using different immune-informatics tools had acceptable scores and was selected as the immunogenic antigen for animal experiment studies. Recombinant TolC protein after expression and purification, was administered to BALB/c mice over three intraperitoneal routes. The sera of mice used to evaluate the IgG1 production assay by indirect-ELISA. The immunized mice depicted effective protection against 2LD50 of Shigella Flexneri ATCC12022 (challenge study). Therefore, the reverse vaccinology approach and experimental test results demonstrated that TolC as a novel effective and immunogenic antigen is capable for protection against shigellosis.