بيان نوتركيب آنزيم هموسرين دهيدروژناز در ميزبان اشرشيا كولي جهت توليد خارج سلولي ترئونين

Recombinant expression of homoserine dehydrogenase enzyme in Escherichia coli for Extracellular production of threonine

در ميان آمينواسيدهاي ضروري، ال-ترئونين به عنوان يك مولكول زيستي موثر بر تقويت سيستم ايمني و مورفولوژي روده عمل مي­كند و در صنايع مختلف به­ويژه دام و طيور كاربرد دارد. لذا توليد كارآمد ال-ترئونين با تكيه بر شناخت مسير متابوليك آن كه شامل 5 مرحله­ي آنزيمي­ست مورد توجه مي باشد. نظر به اينكه هموسرين دهيدروژناز (EC:1.1.1.3) اولين آنزيم كليدي مسير اختصاصي بيوسنتز ترئونين است در اين پژوهش اثر افزايش بيان نوتركيب اين آنزيم در بالا بردن توليد ال-ترئونين بررسي شد. در همين راستا طي مطالعات بيوانفورماتيكي پرايمرهاي اختصاصي ژن thrA طراحي شد. پس از انجام PCR و هضم آنزيمي محصول حاصله و پلاسميد pET-21b(+)، پلاسميد نوتركيب حاوي ژن thrA در سلول­هاي مستعد سويه­ي αDH5 و سپس سلول­هاي BL21(DE3) وارد شد. در مرحله بعد سلول­هاي تراريخت و شاهد در محيط كشت پايه M9 حاوي گلوكز يا گليسرول به­عنوان منبع كربن كشت شدند. ميزان ترئونين موجود در محيط كشت پس از جداسازي سلول­ها به روش نين­هيدرين اندازه­گيري شدند. نتايج از طريق خوانش جذب نوري بيان پروتئين در محيط كشت مذكور بدست آمد كه بيانگر افزايش بيان ترئونين توليدي است. به اين صورت كه پس از گذشت ۱۲ ساعت غلظت در مقايسه با گروه كنترل از 22/0 به 47/1mg/ml رسيد كه افزايش غلظت 25/1 mg/ml را شاهد هستيم. با توجه به پژوهش­هاي محققين، استفاده از كلونينگ تركيبي و توسعه مدل­هاي هيبريد توسط تكنولوژي ديپ لرنينگ ميزان تيتر ترئونين را بالاتر مي­برد. در ادامه، مهندسي ژنتيك ژن­هاي مولد ساير آنزيم­هاي مسير يا مهندسي پروتئين آنزيم­هاي فوق در راستاي افزايش فعاليتشان پيشنهاد مي­شود.

Among essential amino acids, L-threonine is recognized as a bioactive molecule that enhances immune function and intestinal morphology, with significant applications in various industries, particularly in poultry feed industry. Consequently, the efficient production of L-threonine is of considerable interest, hinging on an understanding of its metabolic pathway, which encompasses five enzymatic steps. Homoserine dehydrogenase (EC:1.1.1.3) serves as the first key enzyme in the specific biosynthetic pathway for threonine. This study investigates the impact of enhancing the recombinant expression of this enzyme on L-threonine production. So, specific primers for the thrA gene were designed through bioinformatics analyses. Following polymerase chain reaction amplification and enzymatic digestion of the resulting product and the pET-21b(+) plasmid, a recombinant plasmid containing the thrA gene was introduced into the competent cells of the DH5α strain and subsequently into BL21(DE3) cells. The recombinant and control cells were cultured in M9 minimal medium supplemented with glucose or glycerol as carbon sources. The concentration of threonine in the culture medium was quantified post-cell separation using ninhydrin assay and compared across samples. Results indicated an increase in threonine production, evidenced by a rise in concentration from 0.22 to 1.47 mg/ ml after 12 hours which was compared to the control group, resulting in an increase of 1.25 mg/ml. According to prior research, employing combinatorial cloning and developing hybrid models through deep learning has been shown to enhance threonine titers. Furthermore, genetic engineering of genes encoding additional pathway enzymes or protein engineering of these enzymes is recommended to augment their activity.