ساب كلونينگ ژن زير‌واحد آلفاي هورمون‌ هاي گليكوپروتئيني بخش پيشين غده هيپوفيز در يك وكتور بياني سلول‌ هاي پستان‌ داران

Sub-cloning of alpha subunit of anterior pituitary glycoprotein hormone into a mammalian expression vector

سابقه و هدف: هورمون هاي گليكوپروتئيني مترشحه از هيپوفيز قدامي شامل هورمون هاي گليكوپروتئيني انساني شامل هورمون محرك تيروئيد، هورمون لوتئينيزه كننده، هومون محرك فوليكولي و گونادوتروپين كوريوني هستند كه هر يك از دو زير واحد آلفا و بتا تشكيل شده است. زير واحد آلفا در همه هورمون هاي فوق مشابه است و از چهار اگزون و سه اينترون تشكيل شده است. زير واحد بتا مسوول فعاليت اختصاصي هر يك از اين هورمون ها است. هدف اين مطالعه كلونينگ cDNA زنجيره آلفاي هورمون هاي گليكوپروتئيني در وكتور مناسب براي سيستم يوكاريوتي بود. مواد و روش ها: به منظور كلونينگ cDNA زير واحد آلفا هورمون هاي گليكوپروتئيني از T-vector واجد ژن آلفا، به كمك يك جفت پرايمر، cDNA مجددا آمپليفيه گرديد و در سايت هاي Bam HI و Not I پلاسميد pcDNA3.1 كلون گرديد. پلاسميد نوتركيب به سلول E.coli Top10F ترانسفورم شد و كلوني هاي واجد پلاسميد به وسيله Colony PCR انتخاب شدند. صحت پلاسميد تخليص شده از اين كلون ها ابتدا توسط هضم آنزيمي و نهايتا به روش سكانسينگ بررسي شد. يافته ها: آناليز آنزيمي و سكانسينگ نشان داد كه پلاسميد pcDNA3.1-F351α داراي توالي پلاسميدي صحيح مي باشد و تطابق كامل با ژن آلفاي هورمون هاي گليكوپروتئيني گزارش شده در GenBank دارد. نتيجه گيري: اين پلاسميد به دليل ساختار صحيح جهت انتقال به سيستم يوكاريوتي و ارزيابي بيان مناسب مي باشد

Introduction: Anterior pituitary glycoprotein hormones include thyroid stimulating hormone, lutinizing hormone, follicule stimulating hormone, and gonadotropine hormone. Each of them contains alpha and beta subunits. The alpha subunit gene is the same in all of these hormones and contains 4 exones and 3 intrones. The beta subunit is responsible for specific function of each hormone. The aim of this study was to clone alpha chain cDNA of glycoprotein hormones in a proper vector for eukaryotic system. Material and Methods: To clone cDNA, alpha subunit of glycoprotein hormones was amplified by using one pair primers and T.vector as template and cloned in Not I and Bam HI sites of pcDNA3.1 plasmid. The recombinant plasmid transformed to E.coli Top10F΄ cell and colonies that contain plasmid were selected by Colony PCR. The accuracy of extracted plasmid of these clones was approved by enzyme digestion and sequencing. Results: Enzyme analysis showed that pcDNA3.1-F351α had correct structure and sequencing confirmed by 100% homology of the gene with reported alpha gene in Gene Bank. Conclusion: Because of its proper structure, this plasmid is able to transform to Eukaryotic system and translation.