كلونينگ،بيان، تخليص و بررسي فعاليت ضد استافيلوكوكي پروتئين ليزوستافين اوليه در شرايط آزمايشگاهي

Cloning, expression and purification of recombinant prolysostaphin protein and evaluating its in vitro antistaphylococcal activity

سابقه و هدف: استافيلوكوك اورئوس عامل طيف وسيعي از عفونت ها، از عفونت هاي پوستي تا انتشار آن و عفونت هاي سيستميك منجر شونده به نارسايي ارگاني و مرگ مي باشد. مقاومت دارويي در اين گروه از پاتوژن ها يك نگراني جهاني شده و نيازمند توسعه عوامل درماني جديد است. ليزوستافينيك نمونه از اين عوامل مي باشد، ليزوستافينيك باكتريوسين توليد شده به وسيله استافيلوكوك سيمولانس است كه باعث كشتن سلول هاي استافيلوكوك اورئوس از طريق تخريب ديواره سلولي استافيلوكوك مي شود. هدف از اين مطالعه، بيان بالاي ليزوستافين اوليه به شكل نوتركيب و بررسي فعاليت ضد استافيلوكوكي آن بر عليه استافيلوكوك اورئوس تحت شرايط آزمايشگاهي مي باشد. مواد و روش ها: در اين مطالعه، ژن ليزوستافين از استافيلوكوك سيمولانس پس از تكثير با استفاده از واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR) در ناقل پلاسميدي pET32a كلون و بيان شد. پروتئين بيان شده توسط كيت Ni-NTA بر اساس كروماتوگرافي تمايلي تخليص شد. فعاليت آنتي باكتريال آن بر عليه يك سوسپانسيون سلولي از استافيلوكوك اورئوس با استفاده از روش كدورت سنجي مطالعه شد. يافته ها: نتايج PCR و تعيين توالي نشان داد كه ژن هدف به درستي در ناقل مورد نظر كلون شده است. بيان پروتئين به وسيله IPTG القا شد و غلظت هاي بالايي از پروتئين نوتركيب توسط رزين نيكل با فعاليت ضد استافيلوكوكي تخليص شد. نتيجه گيري: pET32a يك سيستم بياني كارآمد در بيان پروتئين نوتركيب پيش ساز ليزوستافين در ميزبان بياني E.coli مي باشد.

Introduction: Staphylococcusaureus causes a wide range of infections, from skin infections disseminated to systemic infections leading to organ failure and death. Drug resistance in this group of pathogens is a world-wide concern and needs the development of novel agents. Lysostaphin, an example of such a novel agents,is a bacteriocin secreted by Staphylococcussimulans to kill Staphylococcus aureus through proteolysis of the Staphylococcus cell wall.The aim of this study was to high level expression and in vitro evaluation of antistaphylococcal activity of recombinant prolysostaphinprotein under invitro conditions. Materials and Methods: In this experimental study, lysostaphin gene of Staphylococcussimulans was amplified by PCR method, then was cloned and expressed into the expression vector pET-32a. The expressed protein was purified by affinity- chromatography using (Ni-NTA) resin kit. The Study of antibacterial activity against a cell suspension of S. aureuswere was performed using turbidity assay. Results: PCR and sequencing results showed the successful cloning of the target gene into the recombinant vector. The expression of protein was induced by IPTG and high concentration of the recombinant protein with antistaphylococcal activity was purified using Ni-NTA resin. Conclusion: Our data showed that, the pET32a expression vector is a very efficient system for producing recombinant prolysostaphin protein in E.coli.