طراحي وكتور لنتي ويروسي pLEX-LAMP-DARPin جهت بيان دارپين هدفمند عليه HER2 در سطح اگزوزوم

Designing pLEX-LAMP-DARPin Lentiviral Vector for Exression of HER2 Targeted DARPin on Exosome Surface

سابقه و هدف: سلول هاي زنده به منظور ارتباط با محيط اطرافشان نانوذرات اگزوزومي آزاد مي كنند.امروزه اگزوزوم به عنوان حامل دارو در تحقيقات مطرح است. اين ذرات را مي توان با بيان ليگاند مخصوص سرطان/ بيماري هدفمند ساخت. پروتئين اتصالي غشا LAMP كه در اگزوزوم بيان مي شود بهترين انتخاب به عنوان نگهدارنده ليگاندي است كه مي تواند به رسپتورهاي اختصاصي سلول هدف متصل گردد. هدف از اين مطالعه طراحي وكتور لنتي ويروسي بوده است كه حامل ژن كايمر جهت بيان پروتئين كايمر LAMP-DARPin در سطح اگزوزوم براي اتصال به گيرنده هاي HER2 در سطح سلول هاي سرطاني است. مواد و روش ها: در اين مطالعه تجربي با RNA استخراج شده از ماهيچه اسكلتي موش cDNA سنتز گرديد وبا پرايمرهاي اختصاصي، ژن LAMP2b تكثير گرديد. با روش SOEing PCR دو سايت برش بين توالي كد كننده سيگنال پپتيد وپپتيد بالغ ايجاد شد وسپس در وكتور لنتي ويروسي pLEX كلون شد. ژن دارپين طراحي ،اپتيمايز، سنتزودر وكتور pLEX-LAMP بين توالي سيگنال وپپتيد بالغ كلون شد و كلونيگ با colony-PCR با تعيين توالي تاييد شد. يافته ها: ژل الكتروفورز محصول واكنش SOEing PCR، بيان گرتكثير بخش كد كننده ژن LAMP2b است. بعد از كلونيگ وجداسازي پلاسميد از كلون هاي مثبت ،تعيين توالي انجام شد كه بلاست توالي در NCBI تاييد كننده توالي ژن LAMP2b است. هم چنين ورود توالي دارپين بين توالي پپتيد سيگنال و پپتيد بالغ به وسيله الكتروفورز وتوالي يابي تاييد شد. استنتاج: در اين مطالعه وكتور لنتي ويروسي PLEX LAMP-DARPin طراحي گرديد كه با كمك آن مي توان ليگاند دارپين را جهت هدفگيري سلول هاي سرطا ني HER2 مثبت در سطح اگزوزوم بيان نمود

Background and purpose: Exosome as drug delivery system is a novel and smart methodology enabling delivery of exosome cargo into specific tissue. This aim could be accessed by manipulation of exosome producer cells for expression of specific transmembrane-anchored ligand on exosomes surface. Accordingly, Lysosomal Associated Membrane Protein (LAMP) is one of the best choices for anchoring and chimerization with any ligand for this propose. In current study we designed a lentiviral vector which carries a chimeric gene for expression of LAMP2-DARPin in exosome to attach to HER2 on cancer cell surfaces. Materials and methods: RNA was extracted from mouse skeletal muscle, then, cDNA was produced by RT-PCR and CDS of LAMP2b gene was amplified by specific primers. Two restriction sites were introduced between signal and mature peptide sequence by SOEing PCR. This fragment was inserted into pLEX-MCS lentiviral vector and cloned in E.coli. DARPin gene was designed, optimized and synthesized, then cloned between signal and mature peptide. Positive clone was confirmed by colony PCR and DNA sequencing. Results: Electrophoresis of SOEing PCR product showed 1290 bp DNA fragment of LAMP2B CDS. Insertion of LAMP2 in pLEX vector was confirmed by electrophoresis and sequencing. Accordingly, DARPins was synthesized and inserted into pLEX-LAMP vector, electrophoresis and sequencing of purified plasmid from positive clone confirmed the insertion of DARPins into pLEXLAMP vector. Conclusion: We generated two lentiviral vectors, pLEX-LAMP for expression of any ligands in exosome surface and pLEX-LAMP DARPin for expression of DARPin on exosome surface for HER2 targeting.