مهندسي آنزيم درماني اوريكاز آسپرژيلوس فلاووس با استفاده از روش جهش زايي هدفدار

ENGINEERING OF THERAPEUTIC ASPERGILLUS FLAVUS URICASE USING SITE-DIRECTED MUTAGENESIS

پيش‌زمينه و هدف: آنزيم اوريكاز آسپرژيلوس فلاووس (EC 1.7.3.3) به‌عنوان يك آنزيم دارويي داراي كاربردهاي درماني ازجمله كاهش اورات سمي بوده و در درمان باليني اختلالات نقرس، نفروپاتي و هايپراوريسمي ناشي از سندروم ليز توموري (TLS) استفاده مي‌شود. علي‌رغم داشتن تمايل و ويژگي بالا در تبديل سوبسترا به محصول، پايداري كم آن در برابر حرارت، كاربرد آن را با محدوديت مواجه ساخته است. براي حل اين چالش راهكارهاي متعددي وجود دارد كه ازجمله آن‌ها مي‌توان به مهندسي پروتئين و دستكاري ژنتيكي اشاره كرد. هدف از اين تحقيق طراحي و ايجاد پل‌هاي دي‌سولفيدي براي اولين بار در آنزيم اوريكاز مي‌باشد. مواد و روش‌ كار: در اين تحقيق با استفاده از مطالعات بيوانفوماتيكي و سرور‌هاي موجود و با در نظر گرفتن كد pdb 1xxj، موقعيت‌هاي صحيح براي ايجاد پيوند دي‌سولفيدي در آنزيم اوريكاز انتخاب شد. سپس با روش جهش‌زايي هدف‌دار و روش SOE-PCR جهش‌هاي انتخابي ايجاد شدند. يافته‌ها: شش جايگاه احتمالي تشكيل پيوند دي‌سولفيدي گزينش شد كه شامل سه پيوند دي‌سولفيدي داخل زنجيره‌اي و سه پيوند دي‌سولفيدي بين زنجيره‌اي شامل Ser 145-Thr 185، Ala 235-Val 248، His 256-Gln 281، Ala 6-Cys290، Ser282-Ser282، Asn12-Asp283 مي‌باشند كه با جهش دادن آن‌ها به سيستئين پيوند دي‌سولفيدي تشكيل مي‌شود. در اين پروژه نتايج حاصل از SOE-PCR و كلونينگ براي جهش نقطه‌اي Ala6 و Ser282 با موفقيت توسط روش‌هاي كلوني PCR و هضم آنزيمي و درنهايت تعيين توالي، تأييد شدند. بحث و نتيجه‌گيري: در اين تحقيق با موفقيت مكان‌هايي براي جهش به اسيدآمينه سيستئين تعيين شد و توسط روش SOE-PCR با موفقيت جهش‌زايي انجام شد.

Background & Aims: As a therapeutic enzyme, Aspergillus flavus (uricase or; EC 1.7.3.3), is used for treatment of urate deposits, gout and nephropathy, hyperuricemia and tumor lysis syndrom (TLS). Despite desirable kinetic features, fragile stability of uricase limits its wide range applications. Therefore, several approaches have developed such as protein engineering and genetic manipulations to overcome these problems. The main aim of the current research was the design and creation of disulfide bridge in therapeutic enzyme uricase for the first time. Materials & Methods: By the help of bioinformatics studies and based on protein data bank (PDB) code: 1xxj, the potential points for disulfide bridge formation were selected. To create mutations, sitedirected mutagenesis using SOE-PCR was employed. Results: According to computational tools, six potential pairs including three intra and three inter-chains were predicted to form disulfide when mutated to cysteins as followings: Ser145-Thr185, Ala235- Val248, His256-Gln281 and Ala6-Cys290, Ser282–Ser282, Asn12-Asp283. By means of SOE-PCR, mutation and cloning of Ala6 and Ser282 was implemented and verified by colony PCR, digestion check and eventually by sequencing. Conclusion: In the current research, we successfully determined the location for mutating to cystein and fortunately implemented mutagenesis by SOE-PCR.