بهينه‌سازي خلوص فاكتور IX انعقادي با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي هپارين و مقايسه آن با كروماتوگرافي تعويض يوني

Improving purification of coagulation F IX using heparin affinity chromatography and its comparison with ion exchange chromatography

سابقه و هدف بيماري هموفيلي B‌، به‌علت كاهش يا عدم وجود فاكتور IX انعقادي مي‌باشد. روش درمان انتخابي براي اين بيمـاران، استفـاده از فاكتـور IX است كه تا حـد امكـان خالص شـده باشد، لذا محققين درصـدد تفكيك و خالص‌سازي پروتئين‌هاي پلاسمايي برآمده‌اند. از روش‌هاي رايج جهت تخليص فاكتور IX مي‌توان استفاده از كروماتوگرافي تعويض يوني را نام برد. ولي از دو دهه قبل به‌تدريج كروماتوگرافي تمايلي نيز به‌كار گرفته شده است. هدف از اين تحقيق در مرحله اول يافتن ميزان خالص‌سازي فاكتور IX با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي هپارين (به‌عنوان روش تكميلي) و سپس مقايسه آن با سيستم كروماتوگرافي تعويض يوني با استفاده از DEAE بوده است. مواد و روش‌ها مطالعـه انجـام شده از نـوع تجربـي بود. به‌منظـور تهيه فاكتـورIX انعقـادي از ستون XK-16 و ژل‌هــاي DEAE- سفاروز و هپارين- سفاروز استفاده گرديد. براي اندازه‌گيري فعاليت انعقادي، كيت پلاسمايي فاقد فاكتور IX و براي اندازه‌گيري ميزان آنتي‌ژن، كيت اليزا مورد استفاده قرارگرفت. يافته‌ها فعاليت ويژه فاكتور IX و در نهايت ميزان خالص‌سازي آن نسبت به پلاسما در كليه مراحل كار مشخص گرديد كه با اضافه شدن يك مرحله كروماتوگرافي تمايلي (هپارين- سفاروز) به روش تهيه فاكتور IX، ميزان فعاليت ويژه فاكتور IX از IU/mg 3/1 به IU/mg 29 افزايش يافت و ميزان خلوص آن در مقايسه با پلاسما حدود 1450 برابر شد. درحالي‌كه در استفاده تنها از كروماتوگرافي تعويض يوني (DEAE- سفاروز)، خلوص فاكتور IX حدود 155 برابر پلاسما مي‌باشد. نتيجه گيري نتايج اين بررسي نشان مي‌دهد كه اضافه نمودن يك مرحله كروماتوگرافي تمايلي با استفاده از هپارين، در افزايش درجه خلوص و فعاليت ويژه اين پروتئين پلاسمايي نقش چشم گيري داشته است.

Background and Objectives Hemophilia B is a genetic disorder due to deficiency or complete absence of factor IX coagulation factor. Treatment of choice for these patients is use of factor IX concentrates. Therefore, purification of plasma proteins and seperation of factor IX have been major objectives for scientists involved in this field. In this respect, purification procedure using ion exchange chromatography is widely used, but in the past decade affinity chromatography was also introduced. The objective of the present study has been to apply both techniques for the purification of factor IX and compare the quality and yield of the product. Materials and Methods For the purification procedure, chromatography columns (XK-16), containing DEAE sepharose and Heparin sepharose were used. Factor IX coagulation activity was measured using a one-stage coagulation assay and factor IX antigen was quantified using ELISA technique. Results The specific activity and relative increase in purity of factor IX was calculated and it was demonstrated that specific activity improved from 3.1 IU/mg using DEAE ion exchange to 29 IU/mg when affinity chromatography was added and purity was increased from 155 to 1450 respectively. Conclusions The present study demonstrates that addition of an affinity chromatography step using heparin sepharose is a major improvement in the purification of factor IX, where both specific activity and purity are increased considerably.