الگوي بازآرايي رده متقاطع ژن‌هاي گيرنده لنفوسيت T از نوع دلتا و گاما در كودكان ايراني مبتلا به لوسمي لنفوبلاستي حاد از نوع پيش‌سازهاي B با استفاده از واكنش زنجيره پليمراز

The pattern of cross lineage t-cell receptor δ/γ gene rearrangements in B-precursor acute lymphoblastic leukemia of iranian children using Polymerase Chain Reaction

سابقه و هدف بازآرايي قطعات ژني درمسيرتكاملي لنفوسيت‌هاي B و T ، تنوع زيادي درمولكول‌هاي گيرنده لنفوسيت(T (TCR ايجاد مي‌كند. درلوسمي‌هاي لنفوئيد ازنوع ALL ، B-precursor علي‌رغم انتظار بازآرايي رده متقاطع در ژن‌هاي TCR ايجاد مي‌گردد. هدف از مطالعه حاضر بررسي الگوي بازآرايي ژن‌هاي TCR (دلتاوگاما) در لوسمي لنفوبلاستي حاد (ALL ) كودكان از نوع پيش سازهاي B توسط واكنش زنجيره پليمراز مي‌باشد. مواد و روش‌‌ها در مطالعه آينده‌نگرحاضر، 183 كودك با تشخيص اوليه لوسمي‌حاد، قبل ‌ازشروع درمان مورد بررسي قرار گرفتند. پس از ارزيابي مورفولوژي و ايمونوفنوتيپ، تنها 140 بيمار با تشخيص B-precursor ALL براي مطالعه انتخاب شدند . سلول‌هاي تك هسته‌اي كه بلاست‌ها را نيز شامل مي‌شدند، با گراديان غلظتي جدا شدند. پس از استخراج DNA ، آزمايش PCR ب ه منظور تكثير منطقه بسيار متغير (TCR-δ (Dδ2-Dδ3, Vδ2-Dδ3 و (TCR-γ ( V γ I ، V γ II ، V γ با استفاده از پرايمرهاي مشترك انجام شد. محصولات PCR پس از تجزيه هترودوپلكس و الكتروفورز برروي ژل پلي‌آكريل ‌ اميد و رنگ‌آميزي نقره مورد بررسي قرار گرفته وپس از تعيين توالي جهت تأييد با توالي‌هاي مشابه در بانك ژني مقايسه شد . آناليز آماري با آزمون‌هاي t ، Mann whitney ، دقيق فيشر و كاي‌دو (Chi-square) انجام شد. يافته‌‌‌ها بازآرايي كلونال TCR- γ شامل V γ I / V γ II و V γ به ترتيب در9/ 64 % و3/ 79% از بيماران وجود داشت (باي كلونال : 5 %). بازآرايي V γ II شايع‌ترين نوع (8/ 46 %) بود. 47 (2/ 45 %) و 11 ( 16/6 %) نفر از بيماران به ترتيب داراي بازآرايي Vδ2-Dδ3 (27/7% باي ‌ كلونال، 3/ 4 % اليگوكلونال) و Dδ2-Dδ3 (يك بيمار با الگوي باي‌كلونال) بودند. نتيجه گيري الگوي كلونال ژن IgH و TCR-δ (Dδ2-Dδ3 ,Vδ2-Dδ3) مشابه جوامع ديگر بود.فراواني بازآرايي TCR-γ V γ II و V γ I قدري بيش از گزارش‌هاي قبلي بوده و بر خلاف بقيه گزارش‌ها به استثناء گزارشي از برزيل، V γ II شايع‌ترين بازآرايي را داشت.هيچ ارتباط معني داري بين انواع مختلف بازآرايي و متغيرهاي كمي وجود نداشت و تنها نكته جالب، كاهش بروز Vδ2-Dδ3 با افزايش سن (بيشتر از 2 سال) بود. با توجه به نتايج حاصل مي‌توان از اين شاخص‌ها در تشخيص كلوناليتي و ارزيابي حداقل بيماري باقي‌مانده استفاده كرد.

Background and Objectives Diversity of heavy chain immunoglobulin (IgH) and T-cell receptor (TCR) molecules is generated during B- and T-lymphocyte differentiation through the rearrangement of variable (V), diversity (D), junction (J) and constant (C) gene segments. Additionally, random insertion and deletions of nucleotides between gene segments make unique sequences which are cell or clone specific. Lymphoid leukemia cells are similar to normal precursors and have rearranged IgH, Igκ and TCR (cross-lineage rearrangement) genes which can be used as a marker of clonality and evaluation of minimal residual disease (MRD). The purpose of this study is to evaluate the pattern of TCR- δ/γ gene rearrangements using polymerase chain reaction (PCR) in B-precursor acute lymphoblastic leukemia (ALL) in Iranian children. Materials and Methods In our prospective study, bone marrow aspirates of 183 children including B-precursor ALLs and with diagnosis of acute leukemia were collected at admission before any chemotherapy. After reviewing cytomorphology and immunophenotyping, only 140 cases with diagnosis of B-precursor ALLs were selected for study. Sixteen were excluded from our study due to various reasons including cellular degeneration. Mononuclear cells including leukemic blasts isolated by density gradient. After DNA extraction, hyper-variable regions TCR- δ (Vδ2-Dδ3 and Dδ2-Dδ3) and TCR- γ(V γ ; V γ I and V γ II) were amplified by consensus primers using PCR. PCR products were analyzed after heteroduplex analysis and polyacrylamide gel electrophoresis (silver stain). The DNA sequences were compared and aligned to the sequences homologous for VγI , Vγ Ⅱ and Vγ of TCR γ , Vδ2-Dδ3 and Dδ2-Dδ3 of TCR–δ published by Gene Bank. Results Clonal rearrangement of TCR-γ (Vγ) and VγI/II were present in 79.3% and 64.9% of patients respectively and only 5% of cases showed biclonal pattern. The VγII rearrangement was the most common (46.8%) type in TCR-γ. 47 (45.2%) and 11 (16.6%) of patients had Vδ2- Dδ3 and Dδ2–Dδ3 partial gene rearrangements, respectively. Biclonal/oligoclonal patterns were present respectively in 27.7% and 4.3% of cases with Vδ2-Dδ3 rearrangement. Only one patient had biclonal Dδ2 Dδ3 rearrangement. Conclusions Clonal rearrangement of TCR-δ (Vδ2-Dδ3 and Dδ2-Dδ3) genes had similar pattern to other populations. Frequency of TCR- γ (V γ I and V γ II) rearrangements were slightly higher than previous reports and in contrast to others except Brazilian report the V γ II rearrangement was the most common type. We found no significant correlation between presence of different types of rearrangements and quantitative variables and the only significat point was the reduction of Vδ2Dδ3 with increase in age . According to preliminary results, these clonal markers can be used in diagnosis and follow up of MRD.