طراحي و ساخت وكتور بياني اختصاصي كراتينوسيت هاي اپيدرمو بررسي بيان فاكتورIX انساني به عنوان مدل

Design and construction of an epidermal keratinocyte-specific expression vector and study of the expression of human factor IX as a model

سابقه و هدف كراتينوسيت يك مدل مناسب براي بيان ژن به صورت ex vivo براي رهاسازي سيستميك پروتئين است. با توجه به اين نكته عناصر كنترلي اختصاصي كراتينوسيت‌ها، گزينه‌هاي مناسبي براي بيان ژن با واسطه كراتينوسيت‌ها هستند. در پژوهش حاضر يك وكتور براي بيان اختصاصي پروتئين‌هاي نوتركيب در كراتينوسيت‌هاي اپيدرم با استفاده از پروموتر ژن كراتين‌ـ‌ 14 انساني طراحي گرديد. توانايي پلاسميد ساخته‌شده به‌وسيله بيان cDNA فاكتور انعقادي IX انسان ي در كراتينوسيت‌هاي اوليه انساني نشان داده‌شد. مواد وروش ها مطالعه انجام شده از نوع تجربي بود. با قرار گرفتن يك قطعه حاوي پروموتر ژن كراتين ـ 14 انساني به جاي پروموتر سيتومگالوويروس ( CMV ) در پلاسميد pcDNA3 ، پلاسميد بياني phPK14H ساخته شد. در مرحله بعد cDNA فاكتور IX انساني كه از كتابخانه cDNA كبدي جدا شده بود، وارد پلاسميد بياني شد و پلاسميد pK14hFIX ساخته شد و براي ترانسفكشن كراتينوسيت‌ها مورد استفاده قرار گرفت. كراتينوسيت‌هاي انساني از پوست ختنه نوزادان جدا و با استفاده از محيط كشت عاري از سرم مخصوص كراتينوسيت‌ها كشت داده شدند. سلول‌هاي مزبور با پلاسميد نوتركيب جديد ساخته شده ( pK14hFIX ) با استفاده از فيوجين-6 ترانسفكت شدند. حدود 72 ساعت پس از ترانسفكشن، محيط كشت به‌دست آمده از سلول‌هاي ترانسفكت شده براي بررسي بيان فاكتور IX جمع آوري و سلول‌ها به محيط كشت انتخابي حاوي جنيتيسين منتقل شدند. ادامه كشت سلول‌هاي مزبور در محيط انتخابي منجر به پديدار شدن 9 كلني شد كه در ادامه هر يك به صورت جداگانه كشت داده شده و مورد مطالعه قرار گرفتند. بيان cDNA فاكتور IX با استفاده از آزمون انعقادي يك مرحله‌اي بر روي محيط‌هاي كشت و هم‌چنين انجام RT-PCR بر روي سلول‌هاي كراتينوسيت ترانسفكت مورد مطالعه قرار گرفت. يافته‌ها زمان‌هاي انعقاد به دست آمده از محيط‌هاي كشت سري‌هاي مختلف ترانسفكشن با كنترل‌هاي منفي مقايسه شد. فعاليت انعقادي فاكتور IX نوتركيب در محيط كشت كراتينوسيت‌هاي ترانسفكت شده قبل از تيمار جنيتيسين وپس از انتخاب كلني‌ها با جنيتيسين نشان داده شد. بيان cDNA فاكتور IX در سلول‌هاي ترانسفكت شده هم‌چنين با انجام RT-PCR تاييد شد. نتيجه‌گيري نتايج اوليه ما نظريه‌اي كه كراتينوسيت‌هاي انساني قادر به توليد فاكتور IX فعال تحت كنترل پروموتر كراتين‌ـ14هستند را تاييد مي‌كند. علاوه بر اين پلاسميد ساخته شده حاصل از اين تحقيق ابزار مناسبي براي بررسي بيان پروتئين‌هايي كه از اهميت درماني برخوردارند را در كراتينوسيت‌ها براي مطالعات مختلف بيوشيميايي و سلولي فراهم ساخته است.

Background and Objectives Keratinocyte is a suitable model for ex vivo gene expression strategies for systemic release of a protein. In this regard, keratincyte-specific regulatory elements are especially attractive candidates for keratinocyte–mediated gene expression. In the present study, a vector was designed for specific expression of recombinant protein in human epidermal keratinocytes using human keratin 14 gene promoter. The potential of the constructed plasmid was shown by the expression of human FIX-cDNA in human primary keratinocytes. Materials and Methods A fragment containing human keratin14 gene promoter was inserted in the pcDNA3 plasmid. The human FIX cDNA isolated from a human liver cDNA library was inserted into the recombinant plasmid (phPK 14 H). Human epidermal keratinocytes isolated from neonatal foreskin were cultivated in keratinocyte serum-free medium and transfected with the newly made recombinant plasmid (pK14hFIX) using fugene-6. About 72 hours after transfection, cultured media were collected for expression analysis, and the cells were transferred into selective media containing geneticin. Incubation continued until the appearance of 9 colonies. The expression of human FIX-cDNA was examined by performing one-stage clotting assay as well as RT-PCR. Results The clotting times obtained from the cultured media of different transfection lines were compared to of the negative controls. Indeed the coagulation activity of the expressed rhFIX in the cultured media was detectable both before and after geniticin selection of the transfected keratinocytes. The expression of hFIX-cDNA in the transfected cells was also confirmed by performing RT-PCR. Conclusion Our preliminary results support the idea that human keratinocyte has potential for the production and secretion of biologically active FIX. The expression plasmid constructed in this study, has provided useful means for the expression of different proteins of medical importance in keratinocyte for further biochemical and cellular studies.