شناسايي جهش‌هاي ژن فاكتور IX انعقادي در بيماران هموفيلي B استان اصفهان با استفاده از روش SSCP و تعيين توالي

Mutation analysis of coagulation factor IX gene in Esfahanian hemophilia B patients by SSCP and sequencing

سابقه و هدف هموفيلي B يك بيماري وابسته به جنس مغلوب است كه در اثر كاهش مقدار و يا نقص عملكرد فاكتور IX انعقادي رخ مي‌دهد. ژن فاكتور IX انعقادي به طول 34 كيلو باز، داراي 8 اگزون است. جهش در نواحي مختلف ژن فاكتور IX انعقادي سبب نقص در پروتئين IX انعقادي و بيماري هموفيلي B مي‌گردد. هدف از اين مطالعه تعيين جهش در ژن فاكتور IX انعقادي بيماران مبتلا به هموفيلي B در استان اصفهان و يافتن ارتباط بين ژنوتيپ و فنوتيپ اين بيماران بود. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع توصيفي بود. نمونه‌ها به روش غير تصادفي آسان انتخاب شدند. DNA ژنوميك 24 بيمار مبتلا به هموفيلي B مراجعه كننده به بيمارستان سيدالشهدا(اميد) اصفهان، طبق روش استاندارد استخراج شد. PCR و SSCP بر روي ژل پلي ‌اكريل آميد در شرايط غير تقليب كننده براي كليه اگزون‌ها و نواحي مهم ژن فاكتور IX بيماران انجام گرفت. نمونه‌هايي كه در SSCP ، حركت آن روي ژل در مقايسه با كنترل نرمال متفاوت بود، انتخاب و به روش ختم زنجيره تعيين توالي شدند. توالي‌هاي به دست آمده با نرم‌افزارهاي بايواديت و كروماس تجزيه شدند. يافته‌ها 70/8% جهش‌ها از نوع missense ، 8/3% جهش‌ها از نوع nonsense ، 16/7% جهش‌ها از نوع deletion و 4/2% جهش‌ها از نوع insertion بودند. پلي‌مرفيسم مالمو در يك بيمار مشاهده شد. جهش‌هاي به دست آمده ناهمگن بوده و حدود نيمي از آن‌ها در اگزون 8 رخ داده بود كه با نتايج موجود در بانك اطلاعاتي بيماران هموفيلي B مطابقت داشت. در طي اين تحقيق 4 جهش جديد( C31088G ، C30857G ،A17690C , C6460G ) به دست آمد كه تاكنون گزارش نشده بود. نتيجه گيري از اين يافته‌ها مي‌توان در تشكيل يك بانك اطلاعاتي كشوري و نيز مشاوره ژنتيك در خانواده‌هاي اين بيماران استفاده كرد.

Background and Objectives Hemophilia B is an inherited recessive X-linked bleeding disorder caused by deficiency or defect of procoagulant factor IX (FIX). The factor IX gene spans 35kb of DNA and comprises of 8 exons. Mutations in the factor IX gene may result in deficient or defective coagulation factor IX causing the bleeding tendency known as hemophilia B. The aim of this study was to identify the causative mutations and genotype-phenotype correlation for mutations in some known patients with hemophilia B in Isfahan province. Materials and Methods After informed consent was obtained, genomic DNAs of 24 hemophilia B patients referred to Omid hospital were extracted according to standard protocols. PCR amplification and single strand conformation polymorphism (SSCP) on nondenaturing polyacrylamid gel were performed separately on each sample for eight exons and exon-intron boundaries and promoter. The results of SSCP were compared to normal control and sequencing was performed for those with different migration patterns. Results The sequencing results showed 70.8% missense mutation, 16.7% deletion, 8.3% nonsense mutation, and 4.2% insertion. Many of the mutations had occurred in exon 8; it came out to be similar to haemophilia B mutation database. Malmo polymorphism (Ala 148 Thr) was found in one family. Four novel mutations not previously reported in the database were also found. Conclusions This study confirms the marked heterogeneity of factor IX mutations in the population. The results could be used to develop a national database and offer genetic counselling to families.