راه‌اندازي روش RT-Nested PCR به منظور تشخيص ويروس نقص ايمني اكتسابي تيپ يك

Development of a sensitive RT-Nested PCR for detection of HIV-1

سابقه و هدف ويروس نقص ايمني اكتسابي تيپ يك( HIV-1 ) عامل ايجاد كننده سندرم نقص ايمني اكتسابي انساني”ايدز” مي‌باشد. انتقال بيماري از طريق انتقال خون در دوره پنجره، در مراكز انتقال خون يك معضل جهاني محسوب مي‌شود. علاوه بر اين، نياز مبرمي براي تشخيص سريع، حساس و دقيق عفونت HIV-1 قبل از ظهور آنتي‌بادي در بدن فرد آلوده در بيمارستان‌ها و مراكز بهداشتي احساس مي‌شود. تشخيص ژنوم ويروس HIV-1 در نمونه‌هاي مشكوك، باعث جلوگيري از گسترش بيماري در جامعه و شيوع روز افزون بيماري خواهد بود. با استفاده از اين روش مي‌توان عفونت را در مراحل ابتدايي و قبل از ظهور آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي تشخيص داد. هدف از اين پژوهش طراحي روش بسيار حساس و سريع RT-Nested PCR جهت تشخيص عفونت HIV-1 بود. مواد وروش‌ها پژوهش انجام گرفته از نوع بنيادي ـ كاربردي بود. روش RT-Nested PCR به منظور جداسازي سكانسي حفاظت شده از بخش ژن gag در ويروس HIV-1 طراحي و به كار گرفته شد. ابتدا با كمك روش ترانس‌كريپتاز معكوس، از روي ژنوم RNA ويروس، cDNA ساخته و پس از آن با روش Nested-PCR با استفاده از دو جفت آغازگر اختصاصي و در دو مرحله، قطعه‌اي از ژن مورد نظر ويروس HIV-1 تكثير داده شد و با كمك الكتروفورز، محصولات PCR مورد بررسي قرار گرفت. نتايج به دست آمده با كمك آزمون ANOVA و نرم ‌افزار آماري SPSS تجزيه و تحليل گرديد. يافته‌ها تعداد 25 نمونه سرمي از مراحل مختلف عفونت(شامل مراحل بدون علامت، علامت‌دار و ايدز) و هم‌چنين 15 نمونه پانل استاندارد و 20 نمونه سرمي منفي جمع‌آوري شد و با روش فوق مورد بررسي قرار گرفت. در تمام موارد مثبت، باند مورد نظر بر روي ژل آگارز مشاهده شد، ضمن اين كه در هيچ كدام از نمونه‌هاي منفي، باندي مشاهده نگرديد. نتيجه گيري بر اساس نتايج به دست آمده در اين پژوهش، نشان داده شد كه روش راه‌اندازي شده داراي حساسيت و اختصاصيت بالايي جهت تشخيص عفونت ويروس HIV-1 مي‌باشد. هم‌چنين با توجه به حساسيت روش، به نظر مي‌رسد كه ژنوم ويروسي را مي‌توان قبل از تغييرات سرمي و ظهور آنتي‌بادي‌ها تشخيص داد و از اين رو مي‌توان دوره پنجره‌ تشخيص عفونت را كوتاه‌تر كرد.

Background and Objectives Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is the causative agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) in man and diagnosis of HIV-1 genome in suspicious specimens is of special importance. Viral transmission through blood and blood products during the window period is considered to be an important concern. In addition, the employment of rapid, sensitive and accurate techniques is highly necessary for diagnosis of HIV-1 prior to antibody production in infants born from infected mothers. In the present study, a sensitive and rapid RT-Nested PCR to detect viral genome has developed. Materials and Methods In this study, a sensitive RT-Nested PCR technique for detection of a conserved HIV-1 "gag gene" sequence was developed. By using a specific primer pair, the fragment was amplified in two rounds of PCR. In order to confirm positive results, the developed technique was applied to standard Iranian panel as well as to positive specimens from different infection and disease categories in which reactivity was proven by confirmatory HIV-1 tests (ELISA and western blot). Results Thirty five sera from different stages of the disease as well as 15 standard Iranian panels and 20 negative control sera were collected and tested by the developed technique. In positive cases, a specific band was observed on agarose gel electrophoresis, while no band could be detected for negative control sera. Conclusions In this study, it was demonstrated that the developed HIV-1 RT-Nested PCR has a high sensitivity and specificity for diagnosis of HIV-1 infection. It has the advantage of viral genome detection prior to seroconversion and can be easily applied to detect HIV-1 infection during the window period.