بيان و تخليص ناحيه كاتاليتيك نوروتوكسين بوتولينوم تيپ ‌E‌ نوتركيب از يك ژن ‌صناعي

Expression and Purification of Recombinant Catalytic Domain of Botulinum Neurotoxin Type E from a Synthetic Gene

اهداف: نوروتوكسين‌هاي بوتولينوم، از قوي‌ترين سم‌هاي شناخته‌شده هستند كه با مهار آزادسازي ميانجي عصبي استيل‌كولين، موجب ايجاد فلج شل عضلاني مي‌شود. طراحي مهاركننده‌ها هنوز به‌عنوان يك راهبرد اصلي براي مهار درون‌سلولي مسموميت‌هاي ناشي از سموم مذكور به‌شمار مي‌آيد. براي بررسي پتانسيل عملكرد مهاركننده‌هاي طراحي‌شده، به سم خالص يا ناحيه كاتاليتيك آن نياز است. هدف مطالعه حاضر، بررسي بيان و تخليص ناحيه كاتاليتيك نوروتوكسين بوتولينوم تيپ BoNT/E) E) نوتركيب از يك ژن صناعي بود. مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربي حاضر، توالي زنجيره سبك نوروتوكسين بوتولينوم تيپ E از بانك ژن به‌دست آمد و بهينه‌سازي كدوني بر اساس E. coli BL21 انجام شد. ساير بررسي‌هاي بيوانفورماتيك لازم براي بيان بهتر ژن صورت گرفت. توالي ژن براي سنتز و همانندسازي در وكتور (+)pET28a سفارش داده شد. وكتور نوتركيب داخل باكتري E. coli BL21 انتقال و بيان پروتئين با ايزوپروپيل‌تيو - بتا - دي‌گالاكتوزيداز (IPTG) القا شد. براي بيان محلول، در شرايط بياني تغيير صورت گرفت. سپس به‌وسيله كروماتوگرافي تمايلي و فيلتر آميكون پروتئين خالص‌سازي شد. براي بررسي بيان و خالص‌سازي پروتئين SDS-PAGE و براي تاييد پروتئين بيان‌شده تكنيك وسترن‌بلات به‌كار رفت. يافته‌ها: شاخص سازگاري كدون ژن به 0/85 افزايش يافت. ساختار سوم پيش‌بيني‌شده كيفيت مناسب را نشان داد. ساختار mRNA نشان داد، ساختار پيش‌بيني‌شده پايدار بود. بيان محلول پروتئين در شرايط C °18 به‌مدت 18ساعت با القاي IPTG، يك‌ميلي‌مولار به‌دست آمد. توليد پروتيئن و با خلوص بالاي 90% تاييد شد. نتيجه‌گيري: بهينه‌سازي شرايط بيان پروتئين زنجيره سبك نوروتوكسين بوتولينوم تيپ E موجب توليد محلول آن در محيط كشت توسط ميزبان E. coli BL21 مي‌شود.

Aims Botulinum neurotoxins are the strongest known bacterial toxins that cause muscle paralysis due to inhibition of acetylcholine release. Design of inhibitors is still pursued as a major strategy for intracellular inhibition of poisoning caused by these toxins. Investigation of the potential function of design inhibitors, pure poison or catalytic area is essential. The aims of present study were expression and purification of recombinant catalytic domain of botulinum neurotoxin type E (BoNT/E) Type E from a synthetic gene. Materials & Methods In this experimental study, the sequence of the botulinum neurotoxin type E light chain was adopted from GeneBank and codons were optimized according to E.coli BL21 (DE3) codon usage. Other bioinformatics tools were exploited to reach the optimum expression of the gene in the mentioned host. The resultant (gene) was then ordered to synthesize and cloning in pET28a (+) expression vector. The recombinant vector was transferred into E. coli BL21 (DE3) host cells. The expression of the protein was induced by addition of IPTG. The expression conditions were changed to obtain a soluble expression of the protein. Then, the protein was purified by an affinity chromatography, followed by a further purification with amicon filter. SDS-PAGE was used to evaluate expression and purification of the protein and Western blotting was performed to confirm the expressed protein. Findings Codon Adaptation Index of the gene increased to 0.85. The third predicted structure showed good quality. The thermodynamic analysis of the mRNA structure showed that the predicted structure is stable. The soluble expression was obtained in 18°C and 18h induction by 1 mM IPTG. Protein production with higher more than 90% purity was confirmed. Conclusion Optimization of the protein expression conditions resulted in producing the solution in the culture medium by E. coli BL21 as host.