بررسي نقش نانوذره كيتوزان (Chitosan) همراه شده با پروتئين‌هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا ماژور بر ميزان اپوپتوز ماكروفاژهاي موشي حساس شده با انگل

Studying the role of chitosan nanoparticle loaded with Leishmania major Secretory and excretory antigens on the number of apoptotic macrophages in parasite sensitive mouse

مقدمه و هدف: ليشمانيوز يك معضل بهداشت عمومي است كه توسط گونه­ هاي مختلف ليشمانيا ايجاد مي­شود. القاي اپوپتوز در ماكروفاژهاي آلوده از مكانيسم­هاي اصلي فرار انگل از سيستم ايمني است. جلوگيري از اپوپتوز و تقويت توانايي كشندگي ماكروفاژها مي­تواند در درمان و يا كنترل ليشمانيوز موثر باشد. در اين مطالعه اثر نانوذره كيتوزان همراه شده با پروتئين­هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا ماژور بر ميزان اپوپتوز ماكروفاژها در مواجهه با ليشمانيا بررسي شده است. مواد و روش­ها: پروتئين­هاي ترشحي-تراوشي از سوپرناتانت كشت ليشمانيا ماژور جدا شد. محدوده­ وزن مولكولي پروتئيني و غلظت آن به روشSDS-PAGE و برادفورد تعيين گرديد. آنتي­­ژن­ها با نانوذره كيتوزان همراه شدند. همراه شدن آنتي­ژن و نانوذره به روش FTIR تـأييد گرديد. سميت نانوذره بر ماكروفاژها به روش تست MTT تعيين گرديد. موش­هاي آزمون در روزهاي 0،10،21 به صورت داخل صفاقي با پروتئين­هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا ، نانوذره كيتوزان و پروتئين­هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا همراه شده با نانوذره كيتوزان تيمار شدند. بعد از 28 روز ماكروفاژها جدا شده و درصد اپوپتوز آن­ها در حضور و عدم حضور انگل به روش فلوسيتومتري بررسي گرديد. نتايج: بيشينه توليد پروتئين­هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا ماژور 72 ساعت بعد از كشت انگل است. پروتئين­ها در محدوده 110-35 كيلودالتون قرار دارند. در غلظت 250 μg/ml بيشترين درصد همراهي با نانوذره برابر%76 ديده مي­شود. نتايج MTT عدم سميت تمامي غلظت­هاي نانوذره كيتوزان همراه شده با پروتيين هاي ترشحي-تراوشي را تاييد كرد. نتايج حاصل از سنجش اپوپتوز به روش انكسين نشان داد كه ميزان اپوپتوز در ماكروفاژهاي تيمار شده با نانوذره كيتوزان و كيتوزان همراه شده با پروتيين‌هاي ترشحي-تراوشي به طور معني داري (P≤0.05) از ماكروفازهاي تيمار نشده كمتر است. نتيجه ­گيري: كيتوزان همراه شده با پروتئين­هاي ترشحي-تراوشي ليشمانيا مي­تواند از راه كاهش اپوپتوز، توانايي ماكروفاژهاي آلوده را در حذف انگل افزايش دهد.

Background and Objective: Leishmaniasis is a public health problem caused by different types of Leishmania. The induction of apoptosis in infected macrophages is one of the main mechanisms for the escape of the parasite from the immune system. Preventing apoptosis and enhancing the ability to kill macrophages can be effective in treating or controlling leishmaniasis. In this study, the effect of chitosan nanoparticle loaded with Leishmania major secretory and excretory antigens on the number of apoptotic macrophages on exposure to Leishmania was investigated. Materials and Methods: Secretory and excretory proteins were isolated from the supernatant of the Leishmania major. The protein molecular weight range and its concentration were determined by SDS-PAGE and Bradford method. Proteins were coupled with chitosan nanoparticles. The coupled proteins and nanoparticles were confirmed by FTIR. The nanoparticle toxicity on macrophages was determined by MTT assay. Rats were treated intraperitoneally with protein, nanoparticle, protein coupled with nanoparticles on days 0, 10, and 21. After 28 days, the macrophages were isolated and their apoptosis percentage in presence and absence of parasites was investigated by flow cytometry. Results: The maximum production of Leishmania major secretory and excretory proteins was 72 hours after parasite culture. Proteins were in the range of 35-110 kDa. At a concentration of 250 μg/ml, the highest percentage of nanoparticles was 76%. The results of the MTT confirmed non-toxicity of all chitosan concentrations coupled with Leishmania major secretory and excretory proteins. The results of apoptotic measurements by Annexin showed that apoptosis in macrophages treated with chitosan and chitosan coupled with Leishmania major secretory and excretory proteins was significantly (p<0.05) less than untreated macrophages. Conclusion: Chitosan coupled with Leishmania major secretory and excretory proteins can increase the ability of infected macrophages to remove parasites by reducing apoptosis.