بيان استرپتودورناز نوتركيب در باكتري اشريشيا كلي

The expression of recombinant streptodornase in E.coli bacteria

زمينه و هدف: در عفونت‌هاي چركي پوستي، غلظت چرك در ارتباط با دزاكسي ريبو نوكلئوپروتئين هاست.استفاده از استرپتودورناز كه يك دزاكسي ريبونوكلئاز است به همراه استرپتوكيناز به حل شدن ترشحات كمك ميكند، در نتيجه ترميم زخم در اثر خارج شدن چرك از بافت نكروز شده صورت ميگيرد. هدف از اين مطالعه توليد استرپتودورناز نوتركيب از سوش استرپتوكوك گروه A كه از نظر توليد استرپتودورناز پر بازده است، توسط وكتور بياني ميباشد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه بنيادي- كاربردي، DNA ژنومي ژن استرپتودورناز با روش فنل- كلروفرم استخراج گرديد، سپس با كمك پرايمرهاي اختصاصي ويژه ژن استرپتودورناز، ژن مورد نظر با روش واكنش زنجيره اي پلي مراز تكثير شد. ژن استرپتودورناز به دست آمده در ناقل پلاسميدي SD1T4pGEX جهت بيان كلون شد و پلاسميد SD1T4pGEX وارد باكتري اشريشياكلي سويه بي ال 21 گرديد. توليد پروتئين با القا توسط ايزوپروپيل تيوگالاكتوپيرانوزيد و بهينه سازي شرايط صورت گرفت. پروتئين نوتركيب با استفاده از كيت گلوتاتيون سفاروز 4 ب خالص گرديد. يافته‌ها: ترادف نوكلئوتيدي محصول ژن واكنش زنجيره اي پلي مراز با ژن استرپتودورناز استرپتوكوك گروه A كاملاً يكسان بود. توليد پروتئين نوتركيب استرپتودورناز با القاء پلاسميد SD1T4pGEX توسط تيوگالاكتو پيرانوزيد انجام گرديد. تخليص پروتئين با روش كروماتوگرافي تمايلي و با استفاده از كيت گلوتاتيون سفاروز 4 ب انجام شد. سرم موش واجد آنتي استرپتودورناز در روش وسترن بلات با پروتئين توليد شده واكنش داد. نتيجه‌گيري: توليداسترپتودورناز نوتركيب با استفاده از ناقلين پلاسميدي نظير pGEX در ميزبان اشريشياكلي نيز امكان پذير است. پروتئين توليد شده خاصيت آنتي ژنيك خود را به خوبي حفظ ميكند. با توجه به نياز داخلي كشور و همچنين بازدهي كم توليد و بيماري‌زا بودن استرپتوكوك‌ها توليد اين محصول به صورت نوتركيب امكان پذير است.

Background: In pyoderma infections, the density of pus is related to desoxiribo-nucleoproteins. The use of streptodornase (DNase) in combination with streptokinase can help dissolve purulent secretions of infections which results in healing the wound through the discharge of pus from the necrotic tissue. The aim of this study was to produce recombinant streptodornase from group A strain of Streptococcus pyogenes which is highly efficient in terms of active streptodornase production using expression vector. Materials and Methods: In this applied-fundamental study, genomic DNA of streptodornase gene (sd) was extracted by phenol-chloroform. Then by using specific primers of streptodornase gene, it was amplified through PCR. The resulting streptodornase gene was cloned in pGEX4T1-sd transformer for expression and the pGEX4T1-sd plasmid was transferred to the sd. E.coli BL21. Protein production was done by induction via IPTG and optimization of the conditions. The recombinant protein was purified using the glutathione sepharose 4B kit. Results: The nucleotide sequence of PCR and group A streptodornase Streptococcus was totally the same. The production of the streptodornase recombinant protein was done by inducing pGEX4T1-sd plasmid via Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside. Protein purification was done through affinity-chromatography by using glutathione sepharose 4B. The recombinant protein was reacted with anti-streptodornase mouse serum through Western-Blot method. Conclusion: Recombinant streptodornase can be produced by pGEX4T1 in E. coli. The recombinant protein maintains its antigenic property desirably. Noticing the domestic need in Iran, low rate of production, and pathogenesis of streptococci, production of this recombinant product is feasible.