افزايش بيان اختصاصي ژن Cdk9 بوسيله microRNA-1 بالغ تك رشته در سلول هاي فيبروبلاست

Increasing the specific expression of Cdk9 gene by single-stranded adult microRNA-1 in fibroblast cells

سابقه وهدف: microRNA ها، RNA كوچك (bp22)غير كد شونده هستند كه قادرند بيان ژنها را از مسيرهاي جلوگيري از ترجمه، رونويسي و تخريب RNA مهار كنند. با وجود نقش تنظيمي miR ها در شرايط فيزيولوژيك، تغيير بيان microRNA ها در شرايط بيماري مانند سرطان مشاهده مي شود. بنابرين به منظور تنظيم ميزان بيان miRها در شرايط بيماري و يا جهت مطالعه نقش تنظيمي آنها، بيان microRNA ها را با استفاده از وكتور هاي بيان كننده و يا از طريق سنتز miR بالغ دو رشته اي افزايش مي دهند. مواد و روش ها: در اين مطالعه تجربي تاثير تنظيمي miR-1 تك رشته اي و دو رشته اي بر بيان ژن Cdk9 بررسي شد. سلول هاي فيبروبلاست موشي در محيط DMEM حاوي 10 درصد سرم، 100 U/ml پني سيلين، و 0.1 mg/ml استرپتومايسين كشت داده شدند. به منظور افزايش بيان miR-1 در سلول هاي فيبروبلاست، پلاسميد بيان كننده miR-1 (pPRO-miR-1)، miR-1 سنتزي دو رشته اي و تك رشته اي (3 گروه ) با استفاده از ليپوفكتامين 2000 (Invitrogen, 11668-027) و طبق پروتكل هاي موجود به سلول ها ترانسفكت شده و RNA سلول ها بعد از 48 ساعت بوسيله محلول كيازول (Qiagen, Germany) استخراج گرديد. cDNA سازي از2 µg RNA در حضور آنزيم MLV ريورس ترنسكريپتاز و پرايمرهاي Random hexamer و پرايمر اختصاصي microRNA-1 (شركت زيست رويش) انجام شد. جهت انجام q-PCR از كيت SYBR Green I Master Mix استفاده شد. جهت بررسي اختلاف بين گروه ها از آزمون واريانس ANOVA استفاده شد و سطح اختلاف معناداري بين گروه ها (p value) كمتر از 05/0 در نظر گرفته شد. يافته ها: پس از ترنسفكت سلول ها با پلاسميد بيان كننده miR-1 (pPRO-miR-1)، كاهش 2 برابر بيان ژن Cdk9 در سلول هاي ترنسفكت شده نسبت به گروه كنترل با انجام آزمايش Real time PCR نشان داده شد (p <0.01 ). نتايج مشابهي بعد از ترنسفكت سلول ها با miR-1 بالغ دو رشته اي (22 نوكلئوتيد) مشاهده شد. در ادامه با هدف مقايسه نقش تنظيمي miR-1 بالغ دورشته با تك رشته، سلول ها با miR-1 بالغ تك رشته (22 نوكلئوتيد) ترنسفكت شدند. نتايج حاصل از آزمايش q-PCR و وسترن بلات نشان داد كه miR-1 بالغ تك رشته برخلاف miR-1 دورشته و يا پلاسميد بيان كننده miR، حدود 2 برابر ميزان بيان Cdk9 افزايش مي دهند (p <0.001). نتيجه گيري بر خلاف پلاسميد بيان كننده microRNA و miR بالغ دو رشته اي كه باعث كاهش بيان ژن هدف مي شوند، احتمال دارد microRNA تك رشته نقش فعال كننده بيان ژن هدف را داشته باشد.

Background: MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, non-coding short RNAs (~22 nt) that can downregulate gene expression by translational repression, mRNA degradation, or transcriptional repression. miRNA misregulation has been implicated in pathogenic alterations such as cancer. In order to investigate microRNA functions in gene regulation and/or to modulate their expression in pathogenic conditions, microRNAs are overexpressed by using plasmid or synthetic RNA duplexes designed to mimic the miRNA of interest. Methods: Mouse fibroblast cells were cultured in DMEM containing 10% FBS, 100 U/ml penicillin, and 0.1 mg/ml streptomycin. Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, 11668-027) was used for transfection according to the manufacturer’s instructions. RNA was extracted from cells and tissues using Qiazol (Qiagen, Germany), according to the manufacturer’s protocol. 2 µg RNA samples were reverse transcribed to cDNA using microRNA-1 specific stem loop and random hexamer primers and MLV reverse transcriptase.q-PCR was performed with the ‘SYBR Green I Master Mix’ kit. Results: miR-1-expressing plasmid (pPRO-miR-1) was transfected into fibroblast cells. Quantitative real time PCR determination showed that Cdk9 expression was inhibited in transfected cells compared to control. Similarly, downregulation of Cdk9 was also observed following transfection of 22 nucleotide mature double stranded miR-1. Interestingly, transfection of synthetic 22 nucleotide mature single stranded miR-1 (miR-1-3p) induced Cdk9 expression in the fibroblast cells. Conclusion: Unlike miR-expressing vector or synthetic RNA duplexes designed to mimic the miRNA of interest that can downregulate gene expression, synthetic 22 nucleotide mature single stranded microRNA probably induces gene expression in a locus-specific manner.