پديد آورندگان :
نوجه دهي، شهرزاد دانشگاه آزاد اسلامي، تهران , هاشمي، محمود دانشگاه علوم پزشكي شهيد بهشتي , حسام پور، اردشير دانشگاه آزاد اسلامي، تهران
كليدواژه :
اولتراسانتريفيوژ , جداسازي , سلول‌هاي بنيادي مزانشيم , اگزوزوم
چكيده فارسي :
سابقه و هدف: در سال‌هاي اخير عملكردهاي سلول‌هاي بنيادي مزانشيم در مركز توجه قرار گرفته است. شواهد نشان مي‌دهد سلول‌هاي بنيادي مزانشيم به شيوه‌اي پاراكرين عمل مي‌كنند؛ بنابراين، عوامل بيولوژيكي از جمله اگزوزوم ها و عوامل محلول در آب، در محيط كشت سلول‌ها وجود دارند كه مي‌توانند عملكردي مشابه سلول‌هاي بنيادي مزانشيم داشته باشند. بنابراين جداسازي اگزوزوم ها از سلول‌هاي بنيادي مزانشيم و تعيين خصوصيت آن‌ها و تأييدشان مي‌تواند جهت پيشبرد اهداف درماني در بيماري‌هايي همانند بيماري‌هاي خود ايمن و سرطان مورد استفاده قرار گيرد. استفاده از اگزوزوم هاي جداشده از سوپ و مايع رويي كشت سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي خطرات و مشكلات سلول درماني را ندارد و همچنين كارايي بيشتري نسبت به مايع رويي كشت سلول دارد.
مواد و روش‌ها:در اين مطالعه تجربي از بافت چربي، سلول‌هاي بنيادي مزانشيم استخراج شده است و پس از تعيين هويت سلول‌هاي بنيادي مزانشيم، از سوپ سلولي سلول‌هاي بنيادي مزانشيم با استفاده از روش سانتريفيوژ تفريقي اگزوزوم ها جداسازي گرديد. غلظت اگزوزوم ها با روش بردفورد تعيين و همچنين خصوصيات كيفي آن‌ها توسط ميكروسكوپ الكتروني و دستگاه تفريقي نور تعيين شد.
يافته‌ها:بعد از كشت و پاساژ سلول‌هاي بنيادي مزانشيم،سوپ سلولي بعد از 48 ساعت جمع‌آوري شده و با استفاده از سانتريفيوژ تفريقي با دور g60000 اگزوزوم هاي آن با اندازه‌ي تقريباً 40 تا 100 نانو متر جدا گرديد. ميانگين غلظت آن mg/ml 630 بوده و در تصاوير ميكروسكوپ الكتروني تماميت غشا اگزوزوم هاطي فرايند جداسازي حفظ شده است و ساختار كروي دچار آسيب نشده است. نتايج آناليز دستگاه تفريقي نور نشان مي‌دهد كه تقريباً 70 درصد ذرات داراي ميانگين قطر 90-50 نانو متر و هستند.
نتيجه‌گيري: در مقايسه دو روش جداسازي g 100000 و g60000 در نتايج به دست آمده در پژوهش‌هاي ديگر ذرات اگزوزوم در دورg 10000خالص تر مي‌باشند ولي در دورg 60000 ممكن است ذرات بزرگ‌تري از اگزوزوم مانند ميكرووزيكول ها ديده شوند ولي در نهايت به علت دسترسي كمتر به اولترا سانتريفيوژ با دور g100000 ، جداسازي با دور پايين‌تر هم كاربردي مي‌باشد.همچنين جداسازي اگزوزوم هاي مشتق از سلول‌هاي بنيادي مزانشيم و توليد انبوه آن احتمالاً مي‌تواند به عنوان يك محصول زيست ايمن در درمان بيماري‌ها مورد توجه قرار گيرد.
چكيده لاتين :
Background and Aim: In recent years, Mesenchymal stem cell functions have been at the center of attention of researchers. Evidence shows that Mesenchymal stem cells act as paracrine manner and thus, biological agents such as exosomes and soluble factors are present in the supernatant that can act as same as Mesenchymal stem cells. Therefore, isolating exosomes from mesenchymal stem cells and determining their properties and their validation can be used to achieve therapeutic goals in autoimmune diseases and cancers. The use of exosomes isolated from soup and supernatant mesenchymal stem cell culture does not have any of the risks and problems of cell therapy, and also it is more effective than cell culture
Materials and Methods: In this study, adipose-derived Mesenchymal stem cells were used, after the identification of Mesenchymal stem cells, Mesenchymal stem cells were separated from supernatant using the ultra-centrifugation method. Concentration is determined by Bradford method and also their qualitative properties were determined using an electron microscope and Dynamic Light Scattering.
Results: after culturing and passaging Mesenchymal stem cells, supernatant were collected after 48 hours and its exosomes were separated with a diameter of 40 to 100 nm using an ultra-centrifuge with an approximate acceleration of 60000g. Its Average concentration was 630 mg / ml, and the electron microscope images show that the membrane was not damaged during the separation process and spherical structure was maintained. Analyzed results from the Light differential device shows that almost 70% of the particles have an average diameter of 50-90 nm.
Conclusion: Conclusion: Comparing the two methods of isolating with acceleration of 100,000g and 60000g from the results obtained in other experiments, exosome particles are more pure using acceleration of 10000 g, but using the acceleration 60,000 g, larger particles of exosomes such as Microvesicle may be seen, but ultimately due to difficulty of accessing of a centrifuges with an approximate range of 100,000 gm, separation with the lower accelerations are also applicable. Also, the isolation of mesenchymal derived stem cell exosomes and its mass production may be considered as a bio-safe product in the treatment of diseases.
