توليد آنتي‌بادي مرغي ضد زير واحد B توكسين ويبريو كلرا و راه‌اندازي روش الايزا جهت تشخيص سم‌ ويبريو كلرا

Production of IgY antibody against Vibrio cholerae cytotoxin B and development of an ELISA for detection of cholera toxin

سابقه و هدف: با توجه به اهميت تشخيص سريع سم ويبريو كلرا در نمونه‌هايي مانند آب و يا غذا، در اين مطالعه اقدام به طراحي و راه‌اندازي يك روش ايمنواسي براي شناسايي مستقيم سيتوتوكسين B اين باكتري، با استفاده از آنتي‌بادي مرغي شده است. مواد و روش ها: توالي ژني ctxB در وكتور بياني pET28a كلون شده و سپس در باكتري BL21 (DE3) بيان گرديد. پروتئين‌هاي نوتركيب حاصله پس از تخليص با روش ايمنوكروماتوگرافي، به‌صورت درون ماهيچه‌اي به مرغ تزريق و آنتي‌بادي پلي‌كلونال ضد پروتئين CtxB با استفاده از پلي‌اتيلن گليكول از زرده تخم‌مرغ تخليص شدند. اين آنتي‌بادي‌ها براي طراحي يك روش الايزاي ساندويچ مورد استفاده قرار گرفتند. حساسيت آناليتيك روش طراحي‌شده با استفاده از رقت‌هاي سريالي پروتئين CtxB نوتركيب مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته ها: در ازاء هر ليتر كشت باكتري BL21 (DE3) حاوي پلاسميد دربرگيرنده ژن ctxB، 38 ميلي‌گرم پروتئين نوتركيب با خلوص بيش از 95 درصد توليد گرديد. تيتر آنتي‌بادي ضد CtxB در خون مرغ‌ ايميونيزه برابر با 1 به 32.000 بود و ميزان 9/50 ميلي‌گرم آنتي‌بادي مرغي از هر تخم‌مرغ خالص گرديد. روش الايزاي طراحي‌شده با اين آنتي‌بادي امكان تشخيص CtxB را تا غلظت 33 پيكوگرم بر ميلي‌ليتر فراهم نمود. نتيجه گيري و پيشنهادات: آنتي‌بادي‌هاي مرغي ضد CtxB توليدشده در اين مطالعه، امكان ايجاد يك روش ايمنواسي را فراهم نمودند كه با آن تشخيص سريع و با حساسيت بالاي سيتوتوكسين B فراهم مي‌گردد. لازم است تا در آينده كارآيي اين روش جهت تشخيص سم ويبريو در نمونه‌هاي محيطي مانند آب و يا مواد غذايي مورد بررسي قرار گيرد.

Background: Regarding the importance of rapid detection of cholera toxin in environmental samples, an immunoassay method was developed for direct detection of cytotoxin B. Materials and Methods: The gene sequence of ctxB was cloned to pET28a vector and the recombinant protein was expressed in BL21 (DE3). The recombinant CtxB was purified by affinity chromatography and then used for immunization of chickens. The polyclonal anti-CtxB antibodies were purified from egg yolks by polyethylene glycol. The IgY antibodies were used to develop a sandwich ELISA. Analytical sensitivity of the assay was determined. Results: 38 mg of recombinant CtxB, more than 95% purity, was purified from 1 liter of bacterial culture. The titer of anti-CtxB antibodies in the serum sample of immunized chicken was 1:32,000. The yield of purified IgY was 50.9 mg per egg yolk. The detection limit of the developed ELISA is about 33 pg/ml of recombinant CtxB. Conclusion: Management and control of Vibrio cholerae infection requires the availability of rapid diagnostic tools. The newly developed immunoassay provides a rapid and sensitive method for detection of cytotoxin B of V. cholerae. We plan to evaluate the performance of the developed assay in detection of cholera toxin in environmental and food samples.